酸碱胁迫下凡纳滨对虾DNA损伤与修复的机理研究

养殖水域生态环境的恶化是引起对虾疾病爆发的重要因素之一，其中水体酸碱度是仅次于温度和盐度易于变化的一种环境因子，对养殖对虾造成生理危害甚至导致死亡。本项目尝试从细胞的DNA损伤和修机制切入，利用抑制性消减杂交技术，首次构建不同酸碱胁迫、不同时间段的凡纳滨对虾DNA损伤和修复的消减cDNA文库，检测不同时间点参与DNA损伤与修复的基因变化，并有针对性地克隆与DNA损伤和修复相关的基因，分析其蛋白表达，组织定位，生化活性和细胞学作用，明确它们调控机体应激损伤的作用，以期能对养殖对虾应付环境变化而发生的全面、整体的调控机制进行深层次的了解，为寻找与免疫相关的抗性基因提供线索，为病害防治研究提供理论依据。本研究从生产实际中选题，对于虾类的健康养殖具有重要的意义，为利用对虾自身的免疫修复基因加强抵抗环境胁迫的能力打下了基础。

养殖水域生态环境的恶化是引起对虾疾病爆发的重要因素之一，其中水体酸碱度是仅次于温度和盐度易于变化的一种环境因子，对养殖对虾造成生理危害甚至导致死亡。本项目从细胞的DNA 损伤和修机制切入，利用抑制性消减杂交技术（SSH），首次构建了不同酸碱胁迫、不同时间段的凡纳滨对虾DNA损伤和修复的消减cDNA 文库，检测了不同时间点参与DNA 损伤与修复的基因变化。结果表明，从正反向文库获得的差异EST序列中，主要与凡纳滨对虾的免疫、消化代谢、抗氧化、抗应激、能量合成代谢、信号转导、细胞凋亡、细胞骨架及生物蛋白质合成等多种生理生化功能相关。. 项目组还有针对性地克隆了14个新的与DNA 损伤和修复相关的基因，并对部分基因（11个）的生物学功能进行了重点分析，检测了它们在酸碱胁迫下的表达模式，初步探讨了酸碱胁迫下凡纳滨对虾DNA损伤与修复的机理。研究表明：. 1.酸碱胁迫过程中，凡纳滨对虾体内参与能量代谢和氧化呼吸的基因的表达水平提高，氧化呼吸作用增强，细胞提高了能源产量，产生了大量ATP，帮助细胞抵抗pH值变化导致的环境胁迫，有助于细胞DNA的修复。. 2.与细胞周期和细胞凋亡相关的基因上调，如泛素与蛋白酶体亚基α5、α6，单加氧酶，腺苷激酶和S-腺苷高半胱氨酸水解酶，可能参与或决定着细胞的存活或凋亡，从而起到有效保护受损细胞的关键作用，有助于损伤的DNA在胁迫的剂量范围内发生修复。. 3.RNAi实验证明，在DNA损伤与修复过程中，单加氧酶与抗氧化酶（GST, GPx, CAT）基因之间在功能上是相互联系的。. 4.初步证实了泛素-蛋白酶体途径参与pH胁迫诱导的凡纳滨对虾细胞的DNA损伤与修复，且酸、碱胁迫分别激活蛋白酶体不同的α亚基，推测酸、碱胁迫下凡纳滨对虾的蛋白酶体活性强度不同，选择性降解的底物也会有所不同，从而控制细胞生理活动，调控DNA损伤与修复。. 上述研究结果为寻找与抗逆相关的基因提供了线索，对于进一步探索养殖对虾应付环境变化而发生的全面、整体的调控机制提供了基础资料，对深入研究甲壳动物防御的分子机理也有着重要作用。