磁共振成像活体研究EphB4和EphrinB2基因对肿瘤血管新生的作用

血管新生是肿瘤生长和转移的关键事件。Eph是受体酪氨酸激酶基因中最大家族，包括Eph受体和Ephrin配体。研究发现EphB4和EphrinB2可能在胚胎血管发育和肿瘤血管新生中发挥重要作用。本项目拟构建EphB4、EphrinB2和小干扰RNA载体转染人肿瘤细胞，筛选出基因差异性表达的肿瘤细胞接种小鼠。并合成小分子酪氨酸激酶拮抗剂和可溶性结构域蛋白片段经鼠尾静脉注射，干预肿瘤血管新生。通过多种磁共振成像技术（DCE-MRI,SSCE-MRI和BOLD-MRI）和磁性血管新生靶向探针（RGD-USPIO），在活体上连续动态研究EphB4和EprhinB2对肿瘤新生血管管径、密度、通透性和血流动力学的影响。同时结合光学成像技术研究不同EphB4、EprhinB2基因表达和干预条件下形成的肿瘤新生血管对转移的作用，以阐明EphB4和EphrinB2对肿瘤新生血管结构、功能以及肿瘤转移的作用。

Eph是酪氨酸蛋白激酶受体家族中最大的亚家族，Ephrin是其配体，两者均为膜结合蛋白，相互依赖进行信号转导。Eph/ephrin 通路在肿瘤发生及血管形成中发挥重要作用。然而EphB4是一种多功能蛋白，在不同类型肿瘤、或同种肿瘤的不同阶段发挥的作用并不相同，有时甚至完全相反。关于其在结直肠癌中发挥的作用存在较大争议，且在结直肠癌血管生成中发挥的作用尚未阐明。本项目旨在研究EphB4及ephrinB2在结直肠癌中的表达，更好地探讨其在结直肠癌发生发展及血管形成中的作用。我们采用组织芯片及免疫组化法检测EphB4及ephrinB2在200例结肠癌组织及50例癌旁组织中的表达，结果显示EphB4 蛋白在结直肠癌组织中的表达显著高于正常粘膜，而ephrinB2在两组组织中的表达无显著差异。EphB4高表达与结直肠癌的浸润深度，淋巴结转移，远处转移及TNM分期显著相关。我们进一步利用慢病毒介导的RNA 干扰及基因过表达技术构建稳定沉默及稳定过表达EphB4的结肠癌细胞系。细胞学实验表明，EphB4沉默后，SW480细胞增殖能力减弱，细胞周期阻滞于G0/G1期，凋亡细胞百分数增加。同时沉默组细胞体外运动迁移、细胞基质黏附力及侵袭力减弱。而过表达EphB4后，SW480细胞体外增殖、运动迁移、基质黏附及侵袭力增强。Western blot检测表明EphB4沉默后cyclin-D1、VEGF、MMP-2及MMP-9表达减少而CyclinE、ephrinB2、β-catenin、E-cadherin表达增加。裸鼠皮下移植瘤实验进一步表明，沉默EphB4表达后，SW480细胞成瘤能力减弱，移植瘤体积和重量降低，过表达EphB4移植瘤体积和重量明显升高。用免疫组化法检测CD34，标记移植瘤中微血管的内皮细胞，计算微血管密度MVD，结果表明MVD与EphB4表达密切相关，过表达EphB4的移植瘤中MVD明显增高。同时侵袭转移能力更强，荷瘤鼠模型中可观察到肿瘤细胞的横纹肌、结缔组织浸润及血管侵犯。E-cadherin表达降低提示EphB4高表达的肿瘤细胞间粘附力明显降低。本课题系统地研究了EphB4在结直肠癌中所发挥作用，确定其在结直肠癌发生发展中起促进作用，并促进肿瘤血管的生成。抑制EphB4有望成为结直肠癌治疗的靶点。我们的研究为EphB4作用机制的研究提供了更多的实验基础和理论依据。