Xp11.2易位性肾癌泛素化相关分子调控机制研究

Common features of Xp11.2 translocation renal cell carcinoma are involved in chromosomal translocations and induced transcription factor TFE 3 expression in patients with poor prognosis usually. In previous work, we found the upregulation of hypoxia inducible factor(HIF-1) in these tumors by gene chip expression analysis. And there is evidence that the intervention was involved by ubiquitination mechanism. However, how the two important molecules TFE3 and HIF-1 interact in this pathway in Xp11.2 translocation renal cell carcinoma biological function through the ubiquitin is still unclear. Polyubiquitin affinity beads of ubiquitinated protein affinity enrichment of the project, and the SDS-PAGE separation, mass spectrometry was used to compare ubiquitinated proteins difference. Combined with the expression data of whole genome differences, we will observe the effects of ubiquitin-proteasome degradation pathway in tumor's biological behavior, step by step analyse ubiquitin role of detailed regulatory mechanism between TFE3 and HIF1, assure the exact site in specific TFE3 regulating and HIF-1 ubiquitination, and verify the relationship among this signal pathway, tumor growth and chemosensitivity in vitro and in vivo model. In order to elucidate the pathogenesis of Xp11.2 translocation renal cell carcinoma, we hope this project can provide useful inspiration and identification of specific therapeutic targets.

Xp11.2易位性肾癌共同特征均涉及染色体易位及其所致转录因子TFE3过表达，患者通常预后较差。在前期工作中，通过基因芯片表达谱技术发现缺氧诱导因子HIF-1在此类肿瘤中上调，并提示可能受到泛素化机制的干预。但是TFE3与HIF-1这两个重要分子是如何通过泛素化途径发生作用以及此通路在Xp11.2易位性肾癌中的生物学功能目前尚不清楚。本项目利用多聚泛素亲和磁珠对泛素化蛋白进行亲和富集，然后采用SDS-PAGE分离、质谱鉴定等方法，比较泛素化差异性蛋白质谱。结合全基因组差异表达谱数据，观察泛素-蛋白酶体降解途径对肿瘤生物学行为的影响，逐步分析精细泛素化调控机制在TFE3和HIF1之间的作用地位，明确TFE3调控方式及HIF-1发生泛素化的精确位点，体内外模型中验证此调控机制与肿瘤生长和化疗药物敏感性之间的关系。有望为阐明Xp11.2易位性肾癌发病机制，特异性治疗靶点的鉴定提供有益启示。

Xp11.2 易位性肾癌是WHO 新分类的一种肾癌，发病年龄轻、预后较差，主要特征为TFE3 基因发生易位，导致其过表达。因目前尚无针对过表达TFE3建立的肾癌细胞学模型，故作用机制尚不明确，涉及的信号通路有待研究，其诊断及治疗缺乏理论基础。我们利用Real time PCR 和Western blot 方法检测8 种肾源性的细胞系中TFE3 的表达水平，构建特异性慢病毒过表达载体颗粒并鉴定其感染效率并构建稳定感染过表达TFE3 的肾癌细胞系。MTT、平板克隆法检测不同实验组的细胞增殖和克隆形成;Affymetrix 基因芯片分析2 例Xp11.2 易位性肾癌患者癌组织与癌旁组织之间基因表达谱的差异。 Real-time PCR 结果显示TFE3 基因在ACHN 中表达丰度为中，Western blot 结果显示在ACHN 中无目的条带，因此选取ACHN 细胞系作为靶细胞进行慢病毒感染。成功构建人TFE3 特异性慢病毒过表达载体并获得相应高效率慢病毒。在实验组中，Western blot 结果显示OE组中检测到95KD的目的条带，表明过表达TFE3 稳定感染ACHN细胞成功。OE 组的细胞增殖水平和克隆数较NC 组显著升高（p<0.05），说明过表达TFE3能够促进ACHN 细胞的增殖和克隆形成。细胞周期结果显示，OE 组较NC 组的G1 期、G2 期缩短，S 期延长（Ρ<0.05），说明过表达TFE3 能够调控ACHN 细胞的周期从而促进细胞增殖。免疫组化法检测石蜡标本中的mTOR和pS6 在Xp11.2 易位性肾癌较非Xp11.2易位性肾癌中阳性率显著升高（Ρ<0.05），两种蛋白在OE 组中表达显著增高（p<0.05），说明该肿瘤在组织学和细胞学层面都存在PI3K/AKT/mTOR 通路的过度激活。cDNA 芯片检测Xp11.2 易位性肾癌患者相关差异表达的基因。共筛选出差异表达基因1479 个，癌组织中上调基因790 个，下调基因689 个。其中泛素化相关的RNF180 基因下调5 倍以上，研究结果提示过表达TFE3 能够促进ACHN 细胞的增殖，调控其细胞周期，同时 在Xp11.2 易位性肾癌中存在PI3K/AKT/mTOR 通路的过度激活，Xp11.2 易位性肾癌可能与泛素化途径相关。