EphrinB2/EphB4在脉络膜新生血管发生中的接触信号机制

本研究组前期工作证实，缺氧可通过缺氧诱导因子1(HIF-1)调控血管内皮生长因子(VEGF)表达，促进脉络膜新生血管(CNV)生成。但局部过表达VEGF并非引发CNV的唯一途径，单纯高表达VEGF并不足以诱发CNV。由于CNV发生过程中存在脉络膜微血管内皮细胞（CEC）和视网膜色素上皮（RPE）细胞的接触作用，早期RPE细胞会促进CNV发生，后期RPE细胞包裹CNV促进CNV回退，提示RPE/CEC间接触信号可能发挥相关作用。本项目从RPE、CEC共有的接触信号分子EphrinB2配体和EphB4受体入手，着重研究RPE、CEC在CNV发生中的关系。本课题拟采用荧光共振能量转移、免疫共沉淀、EphB4缺失的RPE细胞亚系、免疫细胞化学、蛋白印记，实时定量PCR以及细胞共培养技术，研究接触性信号在CNV中所起的作用，从而新的角度探索CNV发生的具体信号机制，为CNV的防治提供新策略。

本项目通过体内体外实验两方面研究了EphrinB2/EphB4在脉络膜新生血管发生中的作用。在体外实验中，原代培养CEC细胞以及RPE细胞，通过免疫荧光染色、实时定量PCR以及Western blot验证了在CEC细胞以及RPE细胞上存在EphrinB2配体以及EphB4受体的表达，利用RPE/CEC共培养系统观察了可溶性EphB4受体（sEphB4）对EphrinB2/EphB4接触性信号通路的阻断作用，抑制了共培养体系中CEC细胞的增生、移行以及管腔化形成。同时发现加入sEphB4并没有对共培养体系中的VEGF分泌产生影响，提示EphrinB4/EphB4信号通路是不依赖VEGF而对CEC的细胞行为产生影响。通过RNA干涉RPE细胞上的EphB4受体后，RPE/CEC共培养模型中CEC的管腔形成受到了抑制。在体内实验中，构建了EphB4基因vshRNA慢病毒载体（LV-shRNA-EphB4），研究了小鼠EphB4基因的vshRNA慢病毒载体抑制目的基因的表达，并观察了小鼠脉络膜新生血管的抑制作用。通过对小鼠通过玻璃体腔注射LV-shRNA-EphB4，干涉EphB4受体后，荧光素血管造影在不同时间点动态观察CNV的变化显示，实验组CNV的渗漏面积及渗漏有效点的生成明显减小，组织病理学及脉络膜铺片检测显示实验组较其他组CNV的高度、宽度和面积均减小，提示LV-shRNA-EphB4对小鼠眼内EphB4受体的干涉效果明确，并对小鼠脉络膜新生血管产生明显的抑制作用。本研究提示从体内体外为进一步探讨EphB4参与CNV的作用机制提供了有力的证据。