纳米氧化锌致人肺上皮细胞结构与功能急性损伤的内在机制研究

Studies have shown that the biological toxicity of ZnO nanoparticles (nZnO) is not only much larger than the ZnO with micrometer size and also higher than many other nanomaterials, the acute cytotoxicity of nZnO within a few hours has attracted great attention. We have also recently found that nZnO can cause acute damage to the membrane structures and physiological functions of living human alveolar epithelial cells. This project intends to continue to use our new-developed high-resolution non-contact hopping probe ion conductance microscopy (HPICM) to perform four-hour real-time dynamic investigation of acute cytotoxicity of nZnO on human alveolar epithelial A549 cells. Under the help of patch-clamp, Flow Cytometry and other existing biological analysis techniques, we will further explore the relationships among the precipitation of Zn2+, intracellular ROS, mitochondrial membrane potential, biological macromolecules, apoptosis, ion channel activity, and the nZnO-induced acute injury. The damage mechanisms of nZnO to alveolar epithelial cell membrane structures and physiological functions will be systemically studied at the cellular, subcellular, biological macromolecules, and the ion channel level. A scientific guidance will be provided for the safety applications of nZnO in the future.

研究表明，nZnO的生物毒性不仅远大于微米粒径的ZnO，也高于其他多种纳米材料，其数小时内的急性细胞毒性已引起人们的高度重视。我们最近也发现nZnO可急性损伤活体人肺泡上皮细胞的膜结构及生理功能。本课题拟继续利用我们构建的探针跳跃离子电导显微镜技术, 以人肺泡上皮A549细胞为模型,实时动态地连续4小时研究nZnO的细胞摄入及其对肺泡上皮细胞膜结构的急性损伤；此外借助膜片钳、流式细胞术等现有成熟的生物分析技术探索游离Zn2+、胞内ROS、线粒体膜电位、生物大分子、细胞凋亡、离子通道活性等与nZnO致细胞急性损伤间的关系。从而在细胞、亚细胞、生物大分子、及离子通道水平上，系统研究nZnO对肺泡上皮细胞膜结构及生理功能的损伤机理，为nZnO的安全应用提供科学指导。

有研究表明，纳米ZnO（nZnO）的生物毒性远大于微米粒径的ZnO，其数小时内的急性细胞毒性已引起广泛关注。我们早前发现nZnO可损伤活体人肺泡上皮细胞的膜结构及生理功能。本研究以nZnO-01及其经物理、化学改性后的两种纳米氧化锌（nZnO-01-D、nZnO-03）为研究对象，比较了它们的理化特性，以人肺泡上皮A549细胞为模型，利用离子电导显微镜技术（HPICM）实时监测nZnO的细胞摄入及其对A549细胞膜结构的急性损伤，此外借助膜片钳、流式细胞术、酶标仪等生物分析技术分别研究了改性前后三种nZnO致A549细胞急性损伤与游离Zn2+、离子通道活性、LDH、胞内ROS、线粒体膜电位、细胞凋亡等之间的关系。本研究显示：（1）较之于改性前的nZnO，改性后的两种nZnO晶粒尺寸、比表面积、表面电位、平均粒径和分散指数都发生了变化，在生理液态环境中的分散稳定性显著改善。（2）ICP、LDH和HPICM实验表明，4 h以内100 µg/mL 以下nZnO析出的游离Zn2+对A549细胞不产生损伤作用。（3）nZnO-03含有的化学改性剂KH550作用于A549细胞4 h以上时其损伤作用明显。（4）A549细胞暴露于nZnO15 min就会抑制细胞膜表面离子通道的电生理功能；暴露2 h会引起明显的LDH、胞内ROS、线粒体膜电位、细胞凋亡变化，对细胞产生急性损伤；暴露4 h时细胞膜的完整性和细胞骨架受到破坏。（5）相比较而言，在短期暴露中，nZnO-01对细胞造成的急性损伤最快最严重，化学改性后的nZnO-03居中，物理改性后nZnO-01-D则比较慢且温和；而且，三种nZnO都存在作用浓度越高其引发的细胞急性损伤越快越严重的情况。本研究从细胞、亚细胞、生物大分子、及离子通道水平上，系统研究nZnO对肺泡上皮细胞膜结构及生理功能的损伤机理，为nZnO的安全应用提供科学指导。