基于R-spondin/Wnt信号网络的原发性骨质疏松易感基因筛选及生物学机制研究

Osteoporosis is widely prevalent among elderly people with aging and/or menopause. Fracture is the most frequent complication of osteoporosis, lowering the life quality and resulting in disability and fatality of patients. Ageing, alcohol, lack of physical exercises and heredity etc. are important risk factors for osteoporosis. The Wnt/β-catenin signaling plays an important role in bone development by promoting osteoblast development and differentiation, as well as up-regulating the OPG gene expression. Many genes in Wnt/β-catenin signaling pathway have been identified susceptible genes related to osteoporosis incidence. By activating Wnt/β-catenin signaling pathway, the recently discovered R-spondin family members can promote bone formation, presenting as the prospective treatment agent for osteoporosis. Therefore, a two-stage multi-center case-control study is designed to identify the osteoporosis- and/or osteoporotic fracture-related single nucleotide polymorphisms (SNPs) of critical genes involved in the R-spondin/Wnt signaling network by using the bioinformatics technology. Biological mechanisms of the identified SNPs will also be explored, especially that of the SNPs locating on non-coding regions, which have potential modification functions and gene-gene interactions. Statistical methods will be applied for analysis on the gene-gene and gene-environment interactions. Our findings will present scientific evidence for screening people who are among high risk of osteoporosis and/or fracture, as well as for the future gene therapy to osteoporosis.

中老年人群易发生骨质疏松。脆性骨折是其常见并发症，病人生命质量下降，残疾率和病死率高。除了高龄、酗酒、缺乏体育锻炼等因素，其与遗传密切相关。Wnt/β-catenin信号通过促进成骨细胞发育、分化和上调OPG基因表达等参与调控骨骼发育，其通路上的许多基因与骨质疏松的发生相关。R-spondin蛋白家族成员可激活Wnt/β-catenin信号，促进骨组织形成，对于骨质疏松的治疗具有前景作用。基于此，我们拟设计多中心两阶段病例对照研究，借助生物信息学技术，筛选60岁以上人群R-spondin/Wnt信号网络中骨质疏松和/或骨折易感基因遗传变异位点；并对鉴定得到的变异位点进行生物学机制深入探讨，尤其是位于非编码区域，具有潜在调控功能的SNPs和具有基因-基因交互作用的SNP的分子机制，结合统计学方法分析基因-基因、基因-环境交互作用；从而为骨质疏松高危人群的鉴别及疾病基因治疗提供科学依据。

中老年人群易发生骨质疏松。脆性骨折是其常见并发症，病人生命质量下降，残疾率和病死率高。R-spondin蛋白家族成员可激活Wnt/β-catenin信号，促进骨组织形成，对于骨质疏松的治疗具有前景作用。基于课题资助，我们在武汉市招募年龄60岁以上的老年人为研究对象，严格控制纳入排除标准。通过问卷收集人口学信息、疾病史、生活饮食方式、药物史、月经史、生育史和家族史。采用双能X线测量研究对象腰椎（L1-L4）和股骨骨密度，并利用FRAX软件计算研究对象的骨折风险。根据WTO骨质疏松评价标准，在腰椎或股骨颈任一部位的骨密度T值≤-2.5就被评为骨质疏松。采用二代测序技术（NGS）完成了400例研究对象78个基因目标区域（启动子区、外显子、外显子与内含子交界区、3’端UTR区）的测序工作，完成4870个SNP位点测序工作，并完成了相应的生物信息分析。依据NGS检测结果，选取50个骨质疏松关联SNP位点进行扩大样本（n=925）SNPscan检测。通过NGS技术在400名绝经后女性中共检测到1033个位于Wnt/R-spondin信号通路基因的SNVs，通过严格质控后，得到687个高质量SNVs进行后续分析，其中高频SNVs为125个，低频功能性SNVs为100个。本次发现的新SNVs为173个，其中10个为外显子区的非同义突变，1个为插入移码突变。基于基因的SKAT检验结果发现LGR6基因与BMD、T值、Z值和骨质疏松存在统计学关联；LRP6基因与10年骨质疏松性骨折风险和10年髋骨骨折风险存在统计学关联。以gnomAD东亚人群为对照，发现LGR4基因与骨质疏松发生风险存在关联。测序阶段发现rs10920362的TT基因型和rs11178860的AA基因型能显著增加骨质疏松的发生风险，并与BMD、T值和Z值存在负相关；验证阶段成功验证了这一结果。罕见非同义突变rs201256460的T等位基因与BMD、T值、Z值存在负相关；rs750193863的T等位基因与BMD、T值、Z值存在正相关。我们的研究发现将提供Wnt/R-spondin信号通路基因参与骨质疏松症及其骨折发生的人群流行病学证据，为后续对关联SNVs（特别是功能性罕见变异）的生物学机制研究提供科学依据。研究发现将有助于未来疾病高危人群的筛选，为疾病个体化诊断及治疗等提供科学参考。