通过Wnt信号通路筛选何首乌抗骨质疏松的活性成分及研究其作用机制

近年来Wnt信号通路成为骨骼系统相关疾病发病机制和寻找防治策略的新热点。该通路通过调控骨髓基质干细胞（MSCs）和成骨细胞（OB）从而在骨形成中发挥关键作用，因此，通过调控Wnt信号通路来防治骨质疏松（OP）成为可能和研究热点。目前除外一些作用于靶基因的抗体外，还没有发现该通道靶向有效药物。本课题组发现何首乌有抗骨质疏松作用（中国专利号：ZL 00101246.0），作用特点为促骨形成作用明显，对MSCs的分化方向也有调控作用，其作用靶点可能在Wnt通路上。本课题通过建立人或大鼠MSCs、OB体外培养体系和建立去卵巢、糖皮质激素引起骨质疏松的动物模型，采用现代分离提取技术提取何首乌的单体或有效部位群，用基因芯片、PCR、Western Blot、原位杂交等分子生物学方法、骨形态计量学方法、骨生物力学方法等来筛选作用于Wnt通路的何首乌有效成分，证实其对OP的治疗作用及阐明其作用机制。

（1）建立骨髓基质干细胞（MSCs）体外培养体系，并建立体外MSCs成骨诱导和成脂肪诱导模型。该部分的结果发表了相关的论著。（2）动物实验采用长期高脂乳剂灌胃造模，导致大鼠骨量丢失，何首乌水提物能有效对抗高脂大鼠胫骨上段、中段骨和第五腰椎的骨丢失。该部分的结果发表了相关的论著和撰写了研究生毕业论文。（3）何首乌抗骨质疏松活性成分的富集及其化学成分研究。得到21个单体化合物。综合运用各种化学方法和现代波谱学等手段，如紫外光谱、旋光、圆二色谱、红外光谱、核磁共振、质谱等鉴定了其中6个化合物的结构，分别为：①21号化合物：Emodin-1-O-β-D-glucopyranoside；②5、6号化合物：Polygonum 1；③1号化合物：Polygonum 2；④8号化合物：2,3,5,4’-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside；⑤18号化合物：2,3,5,4’-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside；⑥10号化合物：(-)-Catechin。其中5、6号化合物和1号化合物为新化合物，分别命名为Polygonum 1和Polygonum 2。（4）何首乌提取物对大鼠骨髓基质干细胞增殖和成骨分化的影响。通过检测细胞数量和碱性磷酸酶活性，对何首乌不同浓度乙醇洗脱部位进行体外活性筛选，结果表明50%乙醇洗脱部位是何首乌抗骨质疏松有效成分主要富集部位。从50%乙醇洗脱部位分离纯化得到的1（Polygonum 2）、3、8（TSG）、10（(-)-Catechin）、18（TSG）号化合物都可促进BMSCs碱性磷酸酶表达。2，8（TSG），10（(-)-Catechin），18（TSG）号化合物和淫羊藿黄酮可使骨钙素含量升高。（5）何首乌单体化合物对糖皮质激素诱导斑马鱼骨丢失模型的作用。发现5~20μmol/L地塞米松9天可使斑马鱼幼鱼骨骼矿化量减少。2号、3号、8（TSG）号化合物对10 μmol/L地塞米松引起的斑马鱼骨丢失有对抗作用，2号，8（TSG）号化合物的作用比3号化合物明显。何首乌2，5（Polygonum 1），18（TSG）号单体化合物可以降低斑马鱼幼鱼WIF1蛋白和GSK3β蛋白的表达，与地塞米松组相比，WIF1蛋白和GSK3β蛋白的表达量下降。该部分的结果撰写了研究生毕业论文。