DNMT1相关的DNA被动去甲基化在体细胞重编程中的选择性

Both increasing cell proliferation and decreasing DNMT1 expression reduce the global DNA methylation level and promote reprogramming significantly. During our preliminary studies, DNA methylation inheritance requires the function of DNMT1 during G1 phase, shorten G1 phase with cell cycle-related regulators impairs the function of DNMT1 and leads to passive DNA demethylation. Additional studies on the interactions between TET1 and DNMT1 during reprogramming and on the trans-differentiation system from fibroblast to neurons suggest the DNA inheritance and passive DNA demethylation might have selectivity during different cell cycle phases. Thus the current project plans to use whole genome DNA methylation sequencing to investigate, 1) the selectivity of DNA inheritance during different cell cycle phases; 2) the selectivity of passive DNA demethylation during proliferation acceleration or DNMT1 down-regulation in untreated MEFs or in MEFs subjected for reprogramming; 3) combine the whole genome DNA methylation pattern with RNA-seq analysis and explore the contribution of passive DNA demethylation to reprogramming. The current results may also facilitate the understanding on the interactions between DNA active demethylation by TET1 and passive demethylation by DNMT1 during reprogramming and the mechanisms underlying neuronal trans-differentiation. It is believed that the current project will provide new information for the epigenetic regulation during cell fate switch.

促进细胞增殖和降低DNMT1表达可以有效降低细胞整体DNA甲基化水平并提高体细胞重编程效率。前期研究表明，DNA甲基化的稳定遗传需要DNMT1在G1期继续发挥功能，而缩短G1期长度可以影响DNMT1发挥作用并导致DNMT1被动去甲基化。对TET1与DNMT1在重编程中相互作用以及神经细胞转分化系统的研究提示DNA甲基化遗传尤其是相关的被动去甲基化可能具有选择性。因此，本项目计划利用高通量基因组甲基化测序，首先确定DNA甲基化遗传在细胞增殖的不同时期具有怎样的选择性，然后阐明促进细胞增殖和降低DNMT1表达导致的DNA被动去甲基化在正常成纤维细胞中以及重编程过程中的选择性，最后结合转录组测序确定DNA被动去甲基化对体细胞重编程的调控机制。研究结果也可以为研究DNA主动（TET）和被动去甲基化在重编程中的关系以及神经细胞转分化机制提供新的思路，并进一步研究细胞命运转换的表观遗传学机制服务。

细胞增殖，DNA甲基化以及体细胞重编程之间具有非常密切的联系，并且在体细胞重编程中有一个明显的细胞周期加速以及DNA甲基化水平降低的过程。但是DNA整体甲基化水平的降低对细胞命运决定和改变有什么样的作用，尤其是其对体细胞重编程的具体调控机制尚不明确。同时，前期研究确定DNA整体甲基化水平的维持依赖于DNMT1在G1期的功能。因此，本项目主要目标是确定DNA甲基化的稳定遗传以及DNA被动去甲基化是否具有序列或者基因的选择性。基于此，研究团队利用全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）检测利用PI分选的两群MEF细胞（G1期和G2/M期）中的DNA甲基化水平，并发现G1期的MEF细胞的甲基化水平比G2/M期的细胞高接近1%。而通过分析基因转录起始位点前后3.5kb（-1.5~+2.0kb）区域内CpG位点的甲基化水平及这些位点在G1期以及G2/M期中甲基化的差异，研究团队发现：1）该区域DNA甲基化遗传效率与区域内CpG位点的数目及其整体甲基化水平相关；2）转录起始位点前后3.5kb区域内CpG位点的数目在12个/kb~21个/kb之间，整体甲基化水平在40%~60%之间的基因在体细胞重编程的过程中表达上调最明显；3）此部分基因也是基因表达受到DNA去甲基化调控最明显的基因。因此，DNA甲基化遗传虽然在单个位点上不具有选择性，但是在基因水平上具有一定选择性，从而导致基因受到与DNA甲基化相关的表达调控是具有选择性的。在进一步的研究中，研究团队通过简化表观重亚硫酸盐测序（RRBS）以及转录组测序发现，通过促进细胞增殖（shp53）或者抑制Dnmt1的表达诱导DNA被动去甲基化，多能性基因的表达受到更加强烈的促进作用。因此，DNA被动去甲基化可以选择性地促进多能性的获得。项目在执行期内确定了DNA甲基化的稳定遗传以及DNA被动去甲基化具有一定程度的选择性，并揭示了相关选择性机制。项目发表标注科研论文3篇，主要数据投稿中。