5-羟甲基胞嘧啶结合蛋白的鉴定及其对DNA去甲基化的调控和在体细胞重编程中的作用研究

5-methylcytosine (5mC) is an important epigenetic modification that functions in gene silencing, imprinting control, X chromosome inactivation and genome stability control. Recent researches uncovered that TET family enzymes could successively oxidize 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC), which may lead to eventual demethylation by TDG and the base-excision repair pathway. In addition, 5hmC or its further oxidation products may be recognized by putative 5hmC binding proteins. In embryonic stem cells (ESCs), 5hmC and its further oxidated products are often enriched at the enhancers, suggesting that a dynamic regulation of these modifications may play a role in regulating gene expression. In this application, we propose to identify 5hmC binding proteins using quantitative mass spectrometry-assisted DNA affinity purification using mouse ESCs. To explore the in vivo biological functions of our candidate proteins, their genome-wide association and interplay with 5hmC and TET family proteins will be assessed in depth. Given that TET family proteins and DNA oxidation promote cellular reprogramming, we intend to investigate whether our candidate proteins are part of the core transcriptional regulatory network in mouse ESCs and contribute to cell fate decision and reprogramming.

DNA胞嘧啶甲基化修饰在基因的长期沉默、印记基因的表达调控、X染色体失活和基因组稳定性的维持中起着重要作用。近年来的研究发现， DNA上的甲基化胞嘧啶可以被TET家族蛋白逐步氧化成羟甲基化、醛基化和羧基化的胞嘧啶，最终导致去甲基化。甲基化DNA的氧化产物除了作为去甲基过程的中间产物，其自身也可以排斥或者招募一些DNA结合蛋白。在胚胎干细胞中，5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）及其进一步氧化的产物常富集于增强子区域。说明DNA甲基化修饰的动态变化调控，可能参与增强子对基因转录的调控。本申请将利用蛋白质定量质谱技术，鉴定胚胎干细胞特异的5hmC结合蛋白；阐明其选择性结合5hmC的分子机制；利用分子生物学和高通量组学研究5hmC结合蛋白在基因组上的分布，及其与5hmC和TET家族蛋白间的定位关系；此外，还将研究这些蛋白在胚胎干细胞干性维持和体细胞重编程中的作用。

哺乳动物DNA的胞嘧啶甲基化修饰被认为是最稳定的表观遗传修饰，在维持性DNA甲基转移酶的作用下，亲代细胞基因组的DNA甲基化信息经过有丝分裂以半保留复制的方式传递给子代细胞。近来发现，TET家族蛋白能够将5mC逐步氧化成5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-醛基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），并最终实现去甲基化。.自5hmC在哺乳动物基因组上被发现起，人们对它行使功能的方式就有两种主要的猜测：其一是如上所述，作为5mC氧化的中间产物，被继续氧化生成5fC和5caC，并在其他蛋白的帮助下最终完成去甲基化过程；其二是以类似于5-甲基胞嘧啶（5mC）的方式，通过招募能与之结合的蛋白来调节基因转录，5hmC也可作为一种基因组上相对稳定的表观遗传修饰来发挥作用。.本项目从鉴定小鼠胚胎干细胞中能够特异性结合5hmC的蛋白入手，发现锌指结构域蛋白SALL1和SALL4A在体外倾向于结合带有5hmC修饰的DNA。SALL1和SALL4A是早期胚胎发育过程中的重要转录因子，它们的突变分别会导致常染色体显性的Townes-Brocks综合症和Duane-radial ray综合症。本研究发现，在小鼠胚胎干细胞中，SALL1和SALL4A蛋白主要定位在增强子，它们与染色质的结合在很大程度上依赖于TET1蛋白。进一步研究SALL1和SALL4A结合位点上胞嘧啶碱基的修饰状态发现，这些区域缺乏稳定的5hmC，却富集了进一步氧化的产物5fC和5caC，提示这些位点上的5hmC被进一步氧化。通过分析不同基因缺失的胚胎干细胞中，基因组上5hmC分布的变化，我们发现，敲除Sall4导致在原先的SALL4A结合位点上积累较高水平的5hmC，因为敲除Sall4降低了TET2与这些位点的稳定结合，不利于5hmC的进一步氧化。然而，敲除Sall1并不影响基因组上5hmC的分布。.SALL4是体细胞重编程过程中的正调控因子。本项目首先研究了SALL4A促进5hmC进一步氧化的能力对体细胞重编程效率的影响。并继而发现，SALL4A取代OCT4诱导体细胞重编程的功能需要SALL4A结合5hmC的能力。.本项目的研究成果丰富了对TET家族蛋白调控的DNA氧化和去甲基化过程的理解，并提出了5mC的协同性递进氧化概念，促进了对DNA甲基化的动态性及其在胚胎干细胞功能及重编程中作用的理解。