靶向M细胞的乳酸菌表面展示投递体系LL-pSAM的构建及其在幽门螺旋杆菌多价表位疫苗中的实验研究

Whether Microfold cells (M cells) can engulf vaccine antigen and its efficiency of antigen uptake and transport determine the success or failure of oral vaccine and potency. Besides, gastric acid also can hinder oral vaccine from inducing effective mucosal immune responses by degrading vaccine proteins. Therefore, it is a strategy for improving the mucosal immune effect of oral vaccine by developing a mucosal delivery system with the capability of avoiding antigen degradation and promoting the uptake and transport of M cell for antigen. In this study, based on the research of mucosal immune adjuvant and delivery system, a M cell-targeting surface display system of lactic acid bacteria named LL-pSAM, which is composed of M cell targeted peptide, anchoring protein and signal peptide, was designed by analysis of research literatures and bioinformatics softwares. The mucosal delivery system LL-pSAM will be used to assist multivalent epitope vaccine (CWAE, CFAdE and FVpE) against Helicobacter pylori which were proved to have good immunogenicity and immnological specificity. On the one hand, the surface display and M cell target properties of LL-pSAM will be identified by immunological and pharmacological methods, on the other hand, the effect of mucosal delivery and molecular mechanism will be elucidated. This project is aiming to provide experimental and theoretical basis for the development of a mucosal vaccine delivery system with independent intellectual property rights.

胃肠道黏膜的微褶皱细胞（M 细胞）能否摄取疫苗抗原及其对疫苗抗原的摄取量和转运效率决定着黏膜口服疫苗的成败和效力。其次，胃酸对疫苗抗原的破坏也阻碍着黏膜口服疫苗激发有效的黏膜免疫应答。因此，本项目组认为黏膜口服疫苗需要一个可促进M细胞摄取和转运抗原的、且有效避免胃酸对抗原降解的黏膜投递系统与之配伍，达到良好的黏膜免疫效果。本项目在前期黏膜佐剂和投递系统的研究基础上，结合文献依据进行生物信息学软件分析，筛选表面锚定蛋白、信号肽和M细胞靶向肽，自主设计了一种可靶向M细胞的乳酸菌表面展示投递系统LL-pSAM，拟将其辅助于前期已证实具有良好免疫原性和特异性的幽门螺旋杆菌多价表位疫苗（CWAE、CFAdE、FVpE），利用免疫学和药理学等方法研究LL-pSAM的表面展示和M细胞靶向性质，并阐明其黏膜投递效果和分子作用机制。此项目为我国研制出具有自主知识产权的黏膜疫苗投递体系奠定理论依据和实验基础。

本项目按照研究计划顺利完成了各项研究内容和指标，主要概述如下：利用生物信息学并结合文献报道对M细胞杂合肽、信号肽、cA区、多克隆位点等核心原件的组装顺序加以分析和确定，成功设计了一套靶向M细胞的乳酸菌表面展示黏膜投递系统LL-plSAM；利用分子克隆技术获得乳酸菌质粒plSAM，将Hp多价表位肽基因插入plSAM，成功获得了多种重组乳酸菌质粒（plSAM-WAE、plSAM-FAdE和plSAM-FVpE）及其重组乳酸菌株（LL-plSAM-WAE、LL-plSAM-FAdE和LL-plSAM-FVpE）；利用蛋白表达、免疫荧光等技术证实重组乳酸菌均能够成功表达重组抗原，且将其表面展示在细胞壁上；利用重组乳酸菌免疫预防小鼠后，进行Hp攻毒；或利用重组乳酸菌免疫治疗Hp感染的小鼠，通过Hp定量培养、qPCR、尿素酶活性检测、组织病理学等技术评价重组乳酸菌防治Hp感染的效果。实验结果证实各个重组乳酸菌均具有较好的防治Hp感染的效果；其次，利用ELISA、Western blot、尿素酶活性中和等实验，分析重组乳酸菌免疫后小鼠体内淋巴细胞、抗体、细胞因子的种类、水平及变化，探讨重组乳酸菌的免疫保护性机制。实验结果证实重组乳酸菌均具有良好的M细胞靶向性，可促进胃肠道M细胞吞噬和递呈重组抗原，产生针对Hp多种关键毒力和黏附因子的特异性IgG和sIgA抗体体液免疫应答和细胞免疫应答。本项目以主持人为第一或通讯作者发表学术论文6篇，其中SCI论文3篇，单篇最高影响因子为5.511；申请国家发明专利4项，其中已获国家授权3项；项目成果获得宁夏科学技术进步奖三等奖1项、宁夏自然科学优秀学术论文一等奖2篇、罗氏诊断中国医学及生命科学研究基金1项；培养硕士毕业生2名，硕士在读生3名，优秀本科生毕业生3名（以本项目为支撑获得全国大学生挑战杯三等奖）；项目负责人分别在《宁夏第一届临床病原微生物国际学术交流会》、《2016年中西部地区微生物学学术研讨会》和《宁夏医科大学建校60周年系列学术活动暨2018国际医学高峰论坛-临床医学前沿进展研讨会》做相关的学术会议报告3次。本项目临床应用及成果转化的潜力较大，具有巨大的社会和经济效益。