miR-20a/miR-17相关ceRNAs网络调控巨噬细胞抗结核分枝杆菌炎症反应和细胞自噬的作用机制

Autophagy and toll like receptors (TLRs) mediated inflammatory responses are natural defense mechanisms against Mycobacterium tuberculosis (MTB), and they are closely tied and regulated eath other. In our and other study, miR-20a and miR-17 can combine with a negative regulator of TLRs signal (SIRPa) and multiple autophagy related genes (ATGs), then regulate inflammatory response and autophagy. We further speculate that inflammatory responses and autophagy can regulate each other by ceRNAs network that miR-20a/miR-17 competitively bind miR-20a/miR-17. The following studies will be carried out. 1) Severl macrophage models of autophagy, inflammation and MTB infection are construted, and miRNAs with collective differential expression are screened out by small RNA high-throughput sequencing technology. 2) To clarify the targeting relationship between miR-20a/miR-17 and SIRPa or ATGs and confirm the existence of miR-20a/miR-17 related ceRNAs network by using qPCR, western bolt and luciferase reporter assay etc. 3) Reveal the mechanism of miR-20a/miR-17 related ceRNAs network in regulating the inflammatory response and autophagy against MTB in macrophages by using RNAi, immunofluorescence and transmission electron microscopy etc.

自噬和Toll样受体（TLRs）介导的炎症反应都是抗MTB的天然防御机制，二者存在相互作用。本项目前期研究结合文献报道证实miR-20a/miR-17既可结合TLRs信号的负调控因子SIRPa，调控炎症反应，又可结合多个自噬相关基因（ATGs），调控自噬。本项目进一步提出SIRPa和ATGs可竞争性结合miR-20a/miR-17从而构成ceRNAs网络，炎症反应和自噬可通过此ceRNA网络互相调控。拟开展：1）构建自噬、炎症和MTB感染等巨噬细胞模型，利用小RNA高通量测序技术筛选共同差异表达miRNAs；2）利用荧光素酶报告法等技术明确miR-20a/miR-17对SIRPa和ATGs的靶向关系，确证miR-20a/miR-17相关ceRNAs网络的存在。3）通过RNAi、免疫荧光和透射电镜等技术揭示miR-20a/miR-17相关ceRNAs网络调控抗MTB炎症反应和自噬的作用机制。

本项目按照计划完成了各项研究内容和指标，概述如下：（1）建立了雷帕霉素诱导的自噬发生细胞模型，3-MA诱导的自噬抑制细胞模型和H37Ra/BCG感染的细胞模型；通过全转录组测序，利用miRWalk和GO注释等软件筛选出了参与调控巨噬细胞抗MTB炎症和自噬的miRNAs。（2）利用荧光素酶法证实：miR-20a/miR-106a等miRNAs可结合SIRPa和自噬相关基因ATGs（ATG16L1、ULK1和ATG7）3’-UTR；通过qPCR和Western blot等技术证实：miR-20a/miR-106a等miRNAs可调控SIRPa和ATGs的表达。（3）构建miR-20a/miR-106a等过表达或低表达的巨噬细胞模型，利用Western blot、ELISA等技术证实：miR-20a/miR-106a等miRNAs可调控SIRPa、TLRs相关基因和炎性细胞因子的表达，参与调控巨噬细胞抗MTB炎症反应；利用Western blot、免疫荧光、透射电镜、菌落计数等技术证实：miR-20a/miR-106a等可调控ATGs、LC3、P62的表达，影响自噬小体形成和MTB胞内存活率，参与调控巨噬细胞抗MTB的自噬反应。（4）构建SIRPa 3’-UTR过表达巨噬细胞模型，利用qPCR, Western blot、免疫荧光、透射电镜、菌落计数等技术证实：SIRPa可通过miR-20a/miR-106a/miR-17相关性ceRNAs网络调控ATGs、LC3、P62的表达，影响自噬小体形成和MTB胞内存活率，调控巨噬细胞抗MTB自噬反应；构建ATGs 3’-UTR过表达巨噬细胞模型，应用Western blot、免疫荧光、透射电镜、ELISA等技术证实：ATG16L1、ATG7、ULK1可通过miR-20a/miR-106a/miR-17相关性ceRNAs网络调控SIRPa、TLRs相关基因和细胞因子表达，调控巨噬细胞抗MTB的炎症反应。本项目以主持人为第一或通讯作者发表学术论文6篇，其中SCI论文3篇（单篇最高IF=7.561），中文核心3篇；获得宁夏科技进步奖三等奖1项，宁夏自然科学优秀学术论文一等奖1篇，宁夏“挑战杯”学术科技作品优秀指导教师称号；该项目培养硕士毕业生4名，硕士在读生2名，在国内作相关学术汇报2次，举办国际学术会议1次，参加国际学术会议1次。