原癌基因c-myb启动子区G-quadruplex结构的调控及其在小儿低级别胶质瘤靶向治疗中的应用研究

The c-myb promoter contains multiple GGA repeats beginning 17 bp downstream of the transcription initiation site. GGA repeats have been previously shown to form unusual DNA structures in solution. Results from chemical footprinting, circular dichroism and RNA and DNA polymerase arrest assays on oligonucleotides representing the GGA repeat region of the c-myb promoter demonstrate that the element is able to form tetrad: heptad: heptad: tetrad (T:H:H:T) G-quadruplex structures by stacking two tetrad:heptad G-quadruplexes formed by two of the three (GGA)4 repeats. Deletion of one or two (GGA)4 motifs destabilizes this secondary structure and.increases c-myb promoter activity, indicating that the G-quadruplexes formed in the c-myb GGA repeat region may act as a negative regulator of the c-myb promoter. Complete deletion of the c-myb GGA repeat region abolishes c-myb promoter activity, indicating dual roles of the c-myb GGA repeat element as both a transcriptional repressor and an activator. Our findings show that the T:H:H:T G-quadruplex-forming region in the c-myb promoter is a critical cis-acting element and may repress c-myb promoter activity .

基因组中的富G重复序列可以形成独特的G-四链体（G4）二级结构，在基因的复制﹑转录等中发挥重要调控作用，已被确定是一个有效的疾病治疗靶点。小儿低级别胶质瘤（pLGG）是儿童中多发的严重肿瘤，目前还缺乏有效的疗手段。研究证实，原癌基因c-myb的扩增，特别是与QKI基因的重排在pLGG中常见，被认为是其特有的致病驱动因素。我们研究证实，c-myb基因的启动子区可以形成G4结构，选择性稳定这种结构可以抑制启动子的活性，降低转录和蛋白表达，抑制肿瘤细胞增殖，可能是一个特异性的pLGG靶向治疗策略。本课题将进一步借助CD,FRET,NMR及DMS印迹等手段表征此G4结构的稳定性及作用模式，同时利用ChIP-seq﹑EMSA﹑荧光素酶等研究G4形成对转录的调控。最后利用小儿胶质瘤模型探讨G4稳定策略对pLGG放化疗敏感性的影响。本课题为开发新颖的pLGG精准靶向治疗策略提供了新思路。

基因组中的富G重复序列可以形成独特的G-四链体（G4）二级结构，在基因的复制﹑转录等中发挥重要调控作用，已被确定是一个有效的疾病治疗靶点。小儿低级别胶质瘤（pLGG）是儿童中多发的严重肿瘤，目前还缺乏有效的疗手段。研究证实，原癌基因c-myb的扩增，特别是与QKI基因的重排在pLGG中常见，被认为是其特有的致病驱动因素。我们研究证实，c-myb基因的启动子区可以形成G4结构，选择性稳定这种结构可以抑制启动子的活性，降低转录和蛋白表达，抑制肿瘤细胞增殖，可能是一个特异性的pLGG靶向治疗策略。在前期工作的基础上，本项目首先利用生物信息学分析表明原癌基因C-myb高表达在胶质母细胞瘤（IV级）以及较低级别胶质瘤中，C-myb更适合作为胶质母细胞瘤的治疗靶点，其中也包括小儿低级别胶质瘤。圆二色谱，电喷雾质谱等生物物理方法表征证实，C-myb的启动子区可以形成平行G-四链体结构。选择性的配体马钱子碱（Brucine）可以稳定C-myb的启动子区形成的这种平行G-四链体结构。实时定量PCR以及免疫印迹实验证实，C-myb启动子区G4结构的形成显著抑制了C-myb基因的转录以及蛋白水平的表达。荧光素酶报告系统实验表明，马钱子碱诱导的C-myb启动子区G4结构的稳定抑制了启动子的活性。同时染色质免疫沉淀以及体外凝胶阻滞实验证实，C-myb启动子区G4结构的形成抑制转录因子MYB-QKI与启动子区序列的结合。细胞增殖实验证实稳定C-myb启动子区G4结构能剂量依赖性抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖。流式细胞学检测结果表明马钱子碱能够引起胶质母细胞瘤细胞系的细胞周期阻滞，而对细胞凋亡影响不大。免疫蛋白印迹法结果表明，胶质母细胞瘤细胞系的细胞周期相关蛋白cyclin D1和cyclin B1表达显著下调，而凋亡相关蛋白表达变化不大。 研究也证实马钱子碱可以协同提高替莫唑胺和X-rays对胶质瘤细胞的杀伤作用。裸鼠皮下胶质瘤移植瘤模型显示，马钱子碱抑制胶质瘤移植瘤的体内生长，同时增强替莫唑胺对肿瘤生长的抑制效果。本项目对于阐明基因组中富G序列形成的G-四链体结构的生物学活性，进一步理解C-myb在胶质瘤中高表达的机制以及开发新的靶向启动子G4结构的小儿低级别胶质瘤靶向治疗策略具有重要的意义。