内皮细胞单层表观传质性能及低温损伤机理的微流体装置研究

搭建一套基于微流体装置的低温灌流显微镜平台，该平台创造性地集成灌流显微镜和低温显微镜的关键功能，可被广泛用于研究细胞和细胞单层传质性能、细胞低温损伤机理、微流动环境下细胞变形以及细胞与流体相互作用等。构建内皮细胞单层，使用该平台完成内皮细胞单层表观渗透性生物物理学参数及其温变效应的测定，并使用该平台同步模拟细胞低温保存过程胞外溶液浓度和温度的实时变化，完成细胞仿低温保存过程中形态学和存活率的评估。使用低温显微镜对照性实验完成真实低温冷冻保存过程细胞单层中细胞形态学变化、细胞存活率的测定。建立内皮细胞单层胞内冰成核及其生长过程的理论模型，使用测定的细胞生物物理学参数，完成低温保存过程细胞内外水非平衡相变的数值模拟和理论分析，结合低温显微镜实验结果，深入剖析内皮细胞单层低温损伤机理，为组织低温保存提供优化依据。

创造性地集成了低温生物学领域传统的灌注显微镜与商用低温显微镜的技术特征，并加以改良，发明了灌流显微镜系统。该系统最大的技术特色在于细胞周围的温度和浓度实时变化过程可以被高度程序化控制。相对于传统的灌流显微镜而言，该系统可以提供更高精度的细胞外微环境的温度和浓度的控制和实时反馈；而相对于传统的低温显微镜而言，该系统可以提供伪冷冻过程，从而在消除细胞外冰晶干扰的前提下，定量评估细胞脱水过程和细胞内冰晶成核对于细胞造成的损伤。该系统的成功应用，将有利于观测和理解低温生物学领域尚未很好地解决的一些疑难问题。发现了细胞膜水渗透系数的温度和浓度的双重依赖性的定量关系，并通过修正经典的Arrhenius方程，建立了通用的可用于定量描述细胞膜的温度和浓度双重依赖性的关系式。使用本项目发明的灌流显微镜，借助于非平衡渗透性实验，严格验证了该关系式的正确性。该关系式可用于描述低温生物学领域关注的温度和浓度范围下各类细胞膜的水渗透系数，从而极大方便低温保存过程的理论建模和实验优化。改进了Toner提出的用于描述冷冻过程细胞内冰晶成核率随温度变化关系的理论模型，改进后的模型的适用范围得到大大拓宽，可用于描述一般细胞冷冻过程的胞内冰成核现象，而不再受限于细胞尺寸或低温保护剂浓度。结果表明，使用新模型，数据拟合过程理论和实验吻合程度得到了极大的提高，同时拟合所得的系数可用于正确描述更低温度下细胞内冰晶成核率的变化规律。建立了非理想溶液中胞内冰晶成核及其生长的理论模型。该模型有效耦合了Fahy的水输运方程与冰晶成核、扩散控制的冰晶生长理论。模型预测结果表明，细胞内溶液的非理想性，对于慢速冷冻过程的最优化降温速率的预测结果影响较大，但是对于快速冷冻过程、完全玻璃化转变所需的临界降温速率的理论预测影响不大。指出成功的优化低温保存过程，必须充分考虑溶液的非理想性。理论结合实验，系统研究了内皮细胞的非平衡渗透性和胞内冰晶成核过程。发现了一系列新现象，并且修正或建立了新的理论模型，发表了一批高水平学术期刊论文。此外，在实验平台搭建和实验实施过程中，提出了一批新的设计思想和针对已有装置和仪器的改进思想，并获得了相关专利技术。如，灌流显微镜系统、温控系统、细胞分离和低温保护剂去除装置，等。