仿刺参二十碳五烯酸（EPA）生物合成关键酶基因的鉴定及功能分析

The sea cucumber, Apostichopus japonicus, is an important aquaculture animal in China. The kinds and metabolism pathway of the essential fatty acids are the key to fatty acid nutrition of the sea cucumber. In this study, aim to whether or not the sea cucumber use linolenic acidas a precursor to synthesize longer chain highly unsaturated fatty acids such as eicosapntemacnioc acid (EPA，20:5n-3) , starting with the cloning the genes of three kinds key enzymes (△6 and △5 fatty acid desaturase and elongase) in the pathway，then qRT-PCR, immunohistochemistry and RNAi are used to study the function of the genes, and finally a feed experiment is conducted, combined qRT-PCR and immunohistochemistry technology with the content determining of the PUFA in the experiment sea cucumber, to find out the role of the genes in the metabolism，and further the pathway of EPA biosynthesis. The results can provide theoretical bases for study on the mechanism and regulation of the metabolism of polyunsaturated fatty acids in the sea cucumber and other echinoderms. So, it has important theoretical and practical significance.

仿刺参(Apostichopus japonicus)是我国重要的水产养殖动物。仿刺参的必需脂肪酸种类及其转化途径是脂肪酸营养与代谢的关键问题。本研究针对仿刺参n-3系列多不饱和脂肪酸（PUFA）代谢过程中的能否利用亚麻酸（LNA）合成二十碳五烯酸(EPA)等高度不饱和脂肪酸的问题，对仿刺参EPA生物合成途径中的三种关键酶- - △6脂肪酸去饱和酶、△5脂肪酸去饱和酶及脂肪酸延长酶的基因进行克隆，然后采用荧光定量PCR、免疫组织化学以及RNA干扰技术对基因功能进行研究，最后以不同PUFA含量的饲料对仿刺参进行饲喂实验，对实验仿刺参的3个基因的表达情况和体内有关PUFA含量进行测定，经过综合分析，揭示这些基因在仿刺参体内的功能，从而确定仿刺参EPA生物合成途径。该研究的结果可为仿刺参不饱和脂肪酸代谢的营养调控和棘皮动物的脂肪酸代谢机理研究奠定理论基础，具有重要的理论和实践意义。

仿刺参是一种重要的棘皮动物，富含胶原蛋白、酸性粘多糖、皂苷和多不饱和脂肪酸（PUFA），具有很高的药用和营养价值。.本研究首先同源克隆得到了仿刺参高度不饱和脂肪酸（EPA和DHA）合成途径中脂肪酸脱氢酶基因（AJFAD6）和碳链延长酶基因（AJELOVL5）的cDNA全长。 .AJFAD6全长cDNA序列可读区1392bp，编码463个氨基酸（AA），具有FAD6家族的所有典型特征。 AJELOVL5 基因全长1797bp, 编码318 AA，拥有一个组氨酸保守基序，4个跨膜结构域。 .qRT-PCR和半定量RT-PCR结果显示，AJFAD6 和AJELOVL5在不同发育时期幼参和成参组织中均有表达。AJFAD6在附着后150天的呼吸树和100天的肠道，成参肠道和精巢中有较高的表达。AJELOVL5 mRNA在附着后250天肠道和成参体壁中的表达最高。.体外功能验证结果显示，AJFAD6 能催化底物亚油酸 (LA)生成γ-亚油酸 (18:3 n-6, GLA)，α-亚麻酸 (ALA)生成18:4 n-3 (STA)。AJELOVL5 延长酶能将GLA, ARA ( 20:4 n-6), EPA (20:5 n-3)延长, 分别生成DGLA (20:3 n-6), C22:4 n-6 和 C22:5 n-3。.饲喂实验证实，饲料中PUFA 水平和种类调控了仿刺参组织中AJFAD6、 AJELOVL5 表达和PUFA组成。饲料PUFA水平调控幼参组织中AJFAD6 和 AJELOVL5 基因表达。AJFAD6在幼参体壁中有较高表达，且随饲料中ALA含量的增加而升高，而饲料中丰富的DHA抑制AJFAD6表达。其次，幼参饲喂含0.746% ALA, 0.149 EPA and 0.95% DHA的饲料后，其呼吸树和肠道有较高AJFAD6表达。低水平n-3 PUFA 饲料能明显上调幼参AJELOVL5 表达，而高水平n-3 PUFA 饲料抑制AJELOVL5基因表达。AJELOVL5在饲喂ALA0饲料的幼参体壁中高表达，其次为ALA0.746 和 ALA1.271饲喂的幼参，相似的结果也在分别饲喂EPA0.031, DHA0和CK0饲料的幼参组织中出现。.此外，幼参组织中EPA、DHA和ALA的量与饲料中PUFA水平是正相关的。