牦牛乳头瘤病毒I型BgPV-1转录图谱的构建及解析

The production performance of yaks directly affect the living standard in the Qinghai-Tibetan Plateau. The papillomatosis, which is caused by papillomavirus, is one of the important infectious disease affecting the production performance of yaks and occurred frequently during last several years. It can cause mastitis, bleeding during milking and distortion of the milk, and interfere with suckling and milking, and also cause reproduction problems and decline of fur quality. In our previous study, the first papillomavirus strain of yaks was identified and was designated as Bos grunniens papillomavirus type 1 (BgPV-1) by The International Committee on Taxonomy of Viruses. However, the transcription mechanism and other characters of this virus are not studied yet since there is no effective isolation and culture methods for papillomavirus. Therefore, we plan to construct a full transcription map for BgPV-1. Raft cultures derived from yak keratinocytes with BgPV-1 infection and transinfected by BgPV-1 infectious clone will be prepared respectively. Then the start sites and polyadenylation sites for early and late transcripts, splice junctions and other potential promoters in the early and late region, and what regions of the viral genome transcribed will be revealed by 5'/3' RACE and RNA-seq. The results will assist our understanding of BgPV-1 for molecular biological characterization.

牦牛的生产性能直接决定了藏区人民的生活水平，近年来牦牛的乳头瘤病频发，造成乳房炎、哺乳困难、繁殖障碍和毛皮质量下降等问题。本团队在青海省成功地鉴定到了世界上第一株牦牛乳头瘤病毒，被国际病毒分类委员会命名为牦牛乳头瘤病毒I型（BgPV-1）。但由于乳头瘤病毒无法进行体外分离培养的特点，使得BgPV-1的转录方式等尚未得到深入的研究。本研究围绕BgPV-1转录图谱的构建及其转录方式有何特点的科学问题，通过建立从病变部位分离的含有BgPV-1基因组的角质形成细胞的筏式培养体系，以及建立DNA感染性克隆转染后的筏式细胞培养体系，分别对病毒转录后的mRNA采用5'/3' RACE和RNA-seq的分析方法，确定BgPV-1早期和晚期基因转录的起始位点、剪接位点、潜在启动子、多腺苷酸化裂解位点、以及基因组的准确转录区域等，构建BgPV-1的转录图谱。为更好地全面解析该病毒的分子生物学特性奠定基础。

在成功鉴定到牦牛乳头瘤病毒1型（BgPV-1）并对其进行了全基因组序列分析的基础上，本研究首先建立起牦牛角质形成细胞的筏式培养体系，并对该体系中角质形成细胞的生长特性进行了研究，然后构建了BgPV-1的感染性克隆，并成功转染角质形成细胞。提取自然感染和转染感染性克隆后的角质形成细胞的总mRNA，开展了5'/3' RACE和RNA-seq分析，成功地鉴定到了BgPV-1的3个转录起始位点（TSS），分别位于该病毒全基因组的800 nt、7945 nt和7128 nt处，分别命名为P800、P7945和P7128，其中P800位于E1基因内，与位于LCR内的P7945共同作为BgPV-1的早期转录起始位点，而位于LCR内的P7128既作为早期启动位点，同时也作为晚期转录起始位点。进一步分析发现，所有转录起始位点的核苷酸序列均为A或G，这一组成特征符合真核细胞转录位点的核苷酸序列特点。RACE分析结果显示，BgPV-1基因组在4106 nt和7067 nt处的多腺苷酸化位点分别作为早期转录和晚期转录的转录终止信号。本研究在自然感染和感染性克隆转染后的角质形成细胞中，共鉴定到了7个早期转录本和2个晚期转录本，其中P800、P7945和P7128分别作为3个、4个和1个早期转录本的转录起始位点，同时P7128还作为2个晚期转录本的起始位点。通过对这些转录本进行分析，共发现了两个多腺苷酸裂解位点，分别位于4219 nt和7086 nt处。采用5’RACE和引物步移测序技术，对早期和晚期转录本的剪接位点进行分析，共鉴定到了5个供体位点（donor sites）和4个受体位点（accepter sites），这些剪接位点的序列特征与其他乳头瘤病毒相比具有高度的保守性。此外，本研究还对LCR内的E1蛋白结合位点（E1BS）、和E2蛋白结合位点（E2BS）、TATA box等转录元件进行了分析。综合所获得的转录起始位点、转录终止信号、多腺苷酸裂解位点和剪接位点等信息，构建了BgPV-1的转录图谱，为更加全面地了解该病毒的基因表达及致病机理奠定基础。