依布硒啉靶向RIPK1促进神经母细胞瘤程序性坏死的作用与机制研究

Regulated by phosphorylation, ubiquitination, and homo-dimerization. RIPK1 is a critical molecule in necroptosis. Our preliminary study suggests that a seleno-organic compound: ebselen (EbSe), prompted neuroblastoma (NB) cell death which was reversed by necrostatin-1, an inhibitor of RIPK1, but not pan-caspase inhibitor zVAD.fmk. GEO data (GSE62564) analysis showed that the survival of NB patients correlated significantly with the expression of RIPK1. We propose that EbSe induces necroptosis of NB cells through activation of RIPK1. In this study, we will construct RIPK1 knockout cells to verify the key role of RIPK1 in EbSe-induced NB cell death. TH-MYCN mice will be used to check the therapeutic efficacy of EbSe on spontaneous neuroblastoma. The mechanism of EbSe on the regulation of RIPK1 will also be examined. Implementation of this project will demonstrate the significance and mechanism of EbSe-induced NB cells death via targeting RIPK1.

受磷酸化、泛素化及同源二聚体调控，RIPK1是细胞程序性坏死（necroptosis）的关键节点分子。我们发现，RIPK1激酶抑制剂Nec-1能挽救含硒小分子化合物依布硒啉（EbSe）诱导的神经母细胞瘤（NB）死亡，而泛caspase抑制剂zVAD.fmk无此作用；同时，GEO数据（GSE62564）表明RIPK1基因高表达患者生存率显著高于低表达患者。据此，假设EbSe可激活RIPK1以介导NB细胞程序性坏死。我们将首先构建RIPK1敲除细胞，证实其在EbSe促进NB细胞死亡中的关键作用；观察EbSe对NB自成瘤TH-MYCN小鼠的疗效，检测RIPK1及其调控蛋白活性的变化；最后从转录、翻译及翻译后修饰水平探究EbSe对RIPK1磷酸化、泛素化与同源二聚体的影响。本项目的顺利开展可阐明EbSe靶向RIPK1促进NB死亡的作用与机制，并为NB治疗提供新的靶点和药物。

项目背景：神经母细胞瘤（NB）是一种常见的儿童实体瘤，其发病年龄小，风险较大，目前治疗以手术切除、化疗、放疗为主，但由于部分患者对以上治疗方法不能耐受，且预后较差，需要开发新且高效的治疗方法。依布硒啉（Ebselen）是一种含硒化合物，我们预实验发现其可诱导NB细胞死亡，但其机制不明。因此我们对Ebselen诱导NB细胞死亡的机制进行研究，为Ebselen作为潜在的NB治疗药物提供理论依据。主要研究内容：确定Ebselen对NB细胞的细胞毒性及作用浓度，观察Ebselen作用前后NB细胞形态变化，检测Ebselen作用NB细胞前后转录组变化，筛选药物作用靶点，对候选靶点进行功能初步研究，裸鼠成瘤检测Ebselen在体内抑制肿瘤的作用。重要结果：Ebselen对三种NB细胞系均有细胞毒性，而2倍作用浓度下对宫颈癌Hela细胞系、小鼠胚胎成纤维细胞系无细胞毒性。电镜下观察Ebselen作用后，NB细胞呈现坏死样特征。使用凋亡抑制剂、程序性坏死抑制剂、铁死亡抑制剂等细胞特异性死亡抑制剂无法挽救Ebselen导致的NB细胞死亡。二代测序对Ebselen作用NB细胞2小时后转录组进行检测， 结果表明Ebselen可能对细胞蛋白的装配折叠以及多聚化产生负面影响。最后，使用裸鼠进行皮下注射NB细胞，成瘤后灌胃Ebselen，发现Ebselen能显著减少瘤体体积。关键数据：Ebselen对三种NB细胞的IC50中位值为26 μM。Ebselen处理NB细胞后2小时，共389个基因显著上调，42个基因显著下调，基因富集分析表明药物处理后对蛋白装配折叠产生影响最大。选取其中分子伴侣蛋白HSP70和转录因子ATF3进行具体研究，发现Ebselen处理后两种蛋白含量显著上升，但HSP70抑制剂不能挽救Ebselen处理后NB细胞的死亡。体内实验中NB细胞注射裸鼠皮下成瘤后灌胃Ebselen可显著降低成瘤体积（P=0.0297），且瘤体中ATF3蛋白表达量上升。科学意义：Ebselen可作为治疗NB的候选药物，其导致NB细胞死亡的机制可能是通过影响胞内蛋白装配和折叠来产生。