豆渣多糖SRP-Ⅰa一级结构表征及其抑制辐射诱导氧化应激作用机制

Polysaccharide is the main functional component in the soybean residue, but its primary structure and activity mechanism is unclear. In our previous study, SRP-Ⅰa, a polysaccharide harvested from fraction of enzymatic hydrolysis of soybean residue crude fibre, showed significant antioxidant and anti radiation functions. In this project, primary structure of SRP-Ⅰa will be characterized through instrumental analysis (UV spectrum, IR spectrum, GC-MS, HPLC, NMR spectrum) and chemical methods (periodate oxidation degradation, Smith degradation, methylation reaction). Furthermore, the inhibitory effect of SRP-Ⅰa on 60Coγ radiation induced oxidant stress will be studied, and then expression of key factors in mitochondria apoptosis pathway such as Bcl-2/Bax, Cyt-c, caspase-9 and caspase-3 will be determined through immunohistochemistry and western blot technique, to reveal the molecular mechanisms of SRP-Ⅰa’s anti-radiation effect. Research results can provide new research ideas and methods on study of bioactivity mechanism and structure-activity relationship of polysaccharides study, and can provide theoretical basis for the depth development and utilization of soybean and its by-product resources in China.

多糖是大豆豆渣中重要的功能活性物质，但其一级结构和活性作用机制尚不明确。本研究在前期实验证明经酶法降解、多级层析分离纯化技术制备的豆渣多糖SRP-Ⅰa具有明显的抗氧化、抗辐射活性的基础上，拟应用紫外光谱、红外光谱、气相色谱、高效液相色谱、核磁共振波谱、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反应等仪器分析和化学研究方法确定SRP-Ⅰa的一级结构。通过体内实验，对SRP-Ⅰa抑制钴60γ辐射诱导氧化应激作用进行研究，通过免疫组化和蛋白印迹的方法研究SRP-Ⅰa对辐射损伤引起线粒体凋亡途径中Bcl-2、Bax、Cyt-c、caspase-9和caspase-3等关键因子表达的影响，揭示SRP-Ⅰa抑制辐射诱导氧化应激的作用机制。研究结果可为多糖生物活性作用机理及构效关系研究提供新的研究思路和方法上的借鉴，并可为我国大豆及其副产物资源的深度开发利用提供理论基础。

随着科学技术的发展，核技术的广泛应用，电离辐射所引发的氧化应激与人类近百余种疾病密切相关。本研究以豆渣多糖SRP-Ⅰa为研究对象，系统性研究其制备工艺、分离纯化方法、结构表征、抗氧化、抗辐射活性和对辐射诱导氧化应激防护作用机制。本研究采用HPGPC、GC-MS、FT-IR高碘酸氧化-Smith降解和NMR技术对SRP-Ⅰa结构进行表征，研究发现SRP-Ⅰa为均一度较高的多糖，其分子量分布宽度 w/ n=1.19，重均分子量为3.89×103 Da。含有核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等7种单糖组分，其摩尔比为0.82:0.97:2.77:0.63:6.38:70.62:17.82。SRP-Ⅰa的糖残基构型主要为1, 4-β-D-Glcp、1, 3, 6-α-D-Manp和1, 4-α-D-Galp。主链是由Glcp和Manp组成的甘露葡聚糖，(1→)-β-D-Glcp为主链的非还原性末端残基，由1, 3, 6-α-D-Manp通过O-6位与1, 4-α-D-Galp残基构成的侧链相连。通过体外抗氧化筛选模型，证明SRP-Ⅰa可以拮抗电离辐射损伤作用，提高辐射损伤小鼠脾细胞活力，降低小鼠脾细胞DNA的辐射损伤程度，增加细胞抗氧化酶活性，减少丙二醛（MDA）含量。辐射诱导氧化损伤动物模型研究结果表明，SRP-Ⅰa能减轻辐射造成小鼠免疫器官的损伤，显著增加小鼠各脏器中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，提高还原型谷胱甘肽（GSH）含量，降低MDA含量，有效激活抗氧化酶系，减少脂质过氧化，减轻细胞膜的氧化损伤。通过免疫组化和蛋白免疫印迹技术对小鼠脾脏、肝脏组织线粒体介导的细胞凋亡信号途径主要相关蛋白表达进行了研究。结果表明，SRP-Ⅰa防护辐射诱导机体氧化损伤的作用机制是：SRP-Ⅰa通过提高Bcl-2表达水平，抑制Bax表达的上调，降低胞浆Cyt-c表达，继而降低凋亡酶caspase-3活化片段的表达，起到对辐射诱导细胞过度凋亡的抑制作用。SRP-Ⅰa能够改善由电离辐射诱导的氧化损伤，降低活性氧自由基的产生，调节细胞氧化还原和凋亡信号转导，抑制细胞线粒体凋亡信号途径，对辐射诱导氧化伤害具有显著的防护作用。本研究结果对于揭示辐射诱导氧化损伤防护机制及开发研制新型抗辐射药物具有重要的理论价值和应用意义。