泛素E3连接酶接头蛋白SPOP控制离子通道KCNQ1蛋白稳定性影响心肌细胞复极化的机制研究

The ubiquitin-proteasome system (UPS) is a well-controlled, selective mechanism for intracellular protein degradation and turnover. However, the role of UPS played in cardiac electrical activity remain unclear. Speckle-type POZ protein (SPOP), an adaptor for E3 ubiquitin ligase, is a potential regulator of tumorigenesis and organ development. Our preliminary studies showed that, KCNQ1, a key molecule in the depolarization of myocardial cells, was a candidate substrate of SPOP by bioinformatics analysis. We further confirmed the interaction between SPOP and KCNQ1 by CO-IP experiment. Thus, we hypothesized that SPOP might be involved in cardiac electrical activity. In this proposal, we plan to confirm if SPOP could regulate myocardial cell depolarization by ubiquitinating KCNQ1 and further mediate its degradation through UPS. The following experiments: AAV-mediated cardiac-specific SPOP overexpression or knockdown model, electrophysiological analysis of myocardial cells, heart function test, protein interaction in vivo and vitro, ubiquitin-proteasome-triggered degradation, will be performed. Furthermore, small-molecule medication which could regulate SPOP will be used to observe the changes of cardiomyocyte electrical activity. This proposal will for the first time systematically study the function of SPOP in cardiac electrical activity, and the results will provide theoretical basis for novel anti-arrhythmia therapy by targeting SPOP.

泛素-蛋白酶体系统是细胞内最重要的高选择性蛋白质降解方式，但其在心脏电活动中的角色仍不清楚。泛素E3连接酶接头蛋白SPOP负责识别蛋白底物，在除发育和肿瘤外的病理生理中功能尚不清楚。前期我们通过生物信息学方法在人类全蛋白质组范围内筛选到KCNQ1可能是SPOP的识别底物。鉴于KCNQ1在心肌细胞复极中的重要功能，推测SPOP可能参与心脏电活动。初步实验提示SPOP与KCNQ1存在蛋白互作。本申请计划通过腺病毒介导的心脏特异过表达和干扰SPOP动物模型、心肌细胞电生理分析、心功能检测、体内外蛋白互作、蛋白泛素化降解等实验确定SPOP是否通过泛素化KCNQ1，使其进入泛素-蛋白酶体降解途径，从而调节蛋白稳定性参与心肌细胞复极过程。最后评价小分子药物调节SPOP蛋白水平对细胞电活动的影响。本申请首次研究SPOP在心脏电活动中的功能，为干预SPOP作为抗心律失常潜在治疗手段提供了理论依据。

心律失常泛指心脏节律异常，是人类主要的死亡原因之一。近年来，心律失常病因研究取得了一定的进展，鉴定了诸多和心律失常相关的离子通道突变，并开发了相关药物。然而，在临床上针对离子通道治疗心律失常的药物往往存在诸多问题。现亟需探索心律失常发病新机制，为研发新抗心律失常药物提供理论基础。以往关于SPOP 功能研究主要集中于其在机体发育和肿瘤发生过程的作用，但在心律失常发生过程中的作用尚不清楚。为研究SPOP参与心脏电活动的分子机制，我们在小鼠和人类全蛋白质组范围内筛选其潜在底物蛋白。依据SPOP识别底物有五个氨基酸保守序列的特点，利用生物信息学方法筛选得到至少含一段此序列特征（Ф-П-S-S/T-S/T）的蛋白。为缩小潜在靶蛋白范围，我们进一步设置了细胞定位，空间结构等筛选条件，KCND2和KCND3是被发现的候选底物。鉴于KCND2/3在心肌细胞复极中的重要功能，推测SPOP 可能参与心脏电活动，增加心律失常易感性。进一步通过构建心肌细胞条件性敲除SPOP基因的小鼠模型，心肌细胞电生理分析、小鼠心功能检测、体内外蛋白互作和药物干预实验证明：SPOP在体内和体外都能结合KCND2/3，从而调节它们的蛋白稳定性，影响动作电位时程，Ito电流强度和心肌细胞复极化过程，最终参与心脏电活动。小分子激酶抑制剂（帕博西尼）能调节SPOP蛋白水平，对心肌细胞电活动产生影响。本项目研究SPOP在心脏电活动中的功能，为干预SPOP作为抗心律失常潜在治疗手段提供了理论依据。