Keap1/Nrf2/p62-自噬途径与线粒体功能调节在纳米氧化锌致皮肤损伤中的作用研究

ZnO nanoparticles（ZnO NPs）has been widely used in the field of cosmetics, and the threat to consumers’ skin health can’t be ignored. The occurrence and development of dermal damage is closely related to autophagy and mitochondrial function regulation. ZnO NPs and its released Zn2+ can cause autophagy. The Nrf2 pathway mediates autophagy via p62, and Nrf2 also plays an important role in regulating mitochondrial function. However, the specific role of Keap1/Nrf2/autophagy-p62 pathway and mitochondrial function regulation is unknown in dermal toxicity induced by ZnO NPs. Herein, the present project hypothesized that Nrf2 can resist dermal toxicity caused by ZnO NPs with regulating ROS, mediating autophagy by p62 and regulating mitochondrial function. To test this hypothesis, gene silencing and overexpression, co-immunoprecipitation, RT-PCR and live cell imaging will be used to detect ROS production, autophagy-related gene expression and p62 expression, Nrf2 activation and downstream gene regulation, mitochondrial membrane potential and biosynthesis, to confirm whether Nrf2 plays a key role in regulating autophagy and mitochondrial function. This project is aimed to provide important experimental and theoretical evidences for understanding the role of Keap1/Nrf2/autophagy-p62 pathway and mitochondrial function regulation in dermal toxicity induced by ZnO nanoparticles, and provides important ideas and methods for early detection of skin damage and related drug development.

纳米氧化锌已广泛应用在化妆品领域，对消费者的皮肤健康威胁不容忽视。皮肤细胞损伤的发生发展与细胞自噬及线粒体功能调节存在密切联系，纳米氧化锌及其释放的Zn2+可引起细胞自噬。Nrf2通路通过p62介导自噬，同时Nrf2也对线粒体功能具有重要调节作用。但在纳米氧化锌暴露致皮肤损伤的机制研究中，Keap1/Nrf2/p62-自噬途径与线粒体功能调节的具体作用尚不可知。由此，本项目假设：Nrf2通过调控氧化应激、介导p62引起的自噬、调节线粒体功能紊乱，进而抵抗纳米氧化锌暴露引起的皮肤毒性。为证实这一假设，通过检测ROS生成、自噬基因和蛋白表达、Nrf2通路激活及下游基因调控、线粒体功能改变等，确证Nrf2是否通过调控自噬和线粒体功能调节发挥皮肤保护作用，进而揭示线粒体氧化应激与自噬调节在Nrf2抗纳米氧化锌皮肤损伤中的作用，为皮肤损伤早期检测、相关药物研发提供重要思路和方法。

本项目聚焦在化妆品领域广泛应用的纳米氧化锌，关注机体氧化应激和线粒体功能调节，借助对Nrf2信号通路和自噬相关蛋白的研究，旨在揭示线粒体功能调节与自噬在Nrf2抗纳米氧化锌皮肤损伤中的作用及机制。本项目假设：Nrf2通过调控氧化应激、介导p62引起的自噬、调节线粒体功能紊乱，进而抵抗纳米氧化锌暴露引起的皮肤毒性。主要研究内容：纳米氧化锌致皮肤细胞毒性的具体特征及Nrf2通路在其中的作用，线粒体氧化应激损伤特征和自噬调节在皮肤细胞损伤中的作用及机制，Nrf2通路对线粒体功能紊乱和自噬发生发展中的调节作用及机制。主要研究结果：①ZnO NPs处理HaCaT细胞，以剂量和时间依赖性方式引起细胞活力降低和LDH泄漏，显著增加ROS水平，引起MMP丧失；NRF2蛋白表达增加，KEAP1表达降低，且NRF2通路的下游抗氧化基因HO-1、GCLC和GCLM被激活；PINK1和Parkin的mRNA水平和蛋白水平均有所增加；线粒体融合因子MFN1和MFN2的mRNA表达水平降低，而分裂因子DRP1的mRNA水平升高。②ZnO NPs暴露后，与Scramble细胞相比，NRF2-KD细胞活力及MMP显著降低，ROS生成显著增加，NRF2下游抗氧化基因表达受到抑制；NRF2-KD细胞中观察到自噬空泡的数量显著增加。③ZnO NPs在HaCaT细胞中诱导自噬反应，自噬相关蛋白LC3 II/I和P62均增加；自噬抑制剂3-MA预处理后，自噬相关蛋白LC3 II/I的表达降低，细胞活力升高，3-MA能够减轻纳米氧化锌诱导的细胞死亡。科学意义：实验结果提示，具有NRF2抗氧化通路激活和调控线粒体功能的药物或活性物质，可为皮肤损伤早期检测、相关防护措施研发提供重要思路和方法，具有潜在的重要理论意义和实际应用价值。