NLRP2蛋白复合体的鉴定及其在小鼠附植前胚胎中的功能研究

NLRP (Nucleotide-binding domain, Leucine rich Repeat and Pyrin domain containing Proteins) proteins are comprised of an amino-terminal pyrin domain (PYD), a central NACHT domain and carboxy-terminal leucine-rich repeats (LRRs). The PYD and LRRs domain present in many proteins that mainly participate in protein–protein interactions. NLRP proteins play a pivotal role in the innate immune and reproductive systems in mammals. Our research indicated that Nlrp2 is a maternal effect gene, the depletion of this gene in zygotes by RNA interference (RNAi) results in early embryonic arrest. However, the exact molecular mechanism of NLRP2 protein during preimplantation development remains unclear. Based on our previous research, the project will screen proteins those interact with NLRP2 in oocytes and early embryos via RNAi, Co-immunoprecipitation (Co-IP) and Mass spectrometry (MS) techniques, identify the proteins interacting with NLRP2 in 293T cells using Co-IP and western blot, investigate the functions of maternal protein complexes during early embryo development, and reveal the molecular mechanism that Nlrp2 knockdown arrests early embryonic development. If implements smoothly, the project will uncover the physiological function of NLRP2 in the molecular level, provide insights into the roles of this maternal factor in regulating the preimplantation development and extend research thoughts for elucidating the mechanism of early embryo development in mammals.

NLRP蛋白包含3个保守的结构域，其中2个结构域的主要功能是介导蛋白—蛋白之间的相互作用，其在哺乳动物先天免疫系统和生殖系统都起着重要的作用。本课题组前期研究证实Nlrp2是一个母源效应基因，沉默Nlrp2导致小鼠早期胚胎发育阻滞，但其调控机制不详。本项目在前期研究的基础上，以小鼠卵母细胞和早期胚胎为研究对象，采用RNA干扰、免疫共沉淀(Co-IP)和质谱(Mass spectrometry, MS)等技术拟筛选与NLRP2相互作用的蛋白，通过Co-IP和Western blot在293T细胞中进行验证并研究母源蛋白复合体在早期胚胎发育过程中的功能，阐明小鼠早期胚胎因缺少NLRP2蛋白而导致发育阻滞的分子机制。本研究拟从分子水平揭示NLRP2的生理功能，进而为这个母源因子在调控小鼠早期胚胎发育过程中所起的关键作用提供新的见解，也为哺乳动物早期胚胎发育机理的阐明提供新的研究思路。

前期研究证实Nlrp2是一个母源效应基因，沉默Nlrp2导致小鼠早期胚胎发育阻滞，但其调控机制不详。本项目在前期研究的基础上，利用免疫共沉淀和质谱分析技术筛选出可能与NLRP2相互作用的蛋白，通过免疫共沉淀和免疫印迹技术进行交互验证，之后又进一步构建表达载体并转入到293T细胞中进行生理状态下蛋白相互作用的验证；此外，本研究也利用生物信息学方法分析可能与NLRP2相互作用的蛋白并进行交互验证；最终确定与NLRP2相互作用的蛋白并研究该蛋白复合体在小鼠早期胚胎发育过程中的功能。结果表明：NLRP2蛋白与FAF1蛋白和RS3蛋白在小鼠卵母细胞和早期胚胎中存在相互作用；该蛋白复合体主要定位于小鼠卵母细胞和早期胚胎的细胞质中，但在细胞核中也能检测到该蛋白复合体的存在；无论是沉默Nlrp2、Faf1，还是沉默Rs3都将导致小鼠早期胚胎发育阻滞，表明NLRP2-FAF1-RS3蛋白复合体在小鼠早期胚胎发育过程中起着非常重要的作用。本研究从分子水平揭示了NLRP2的生理功能，进而为这个母源因子在调控小鼠早期胚胎发育过程中所起的关键作用提供新的见解，也为哺乳动物早期胚胎发育机理的阐明提供新的研究思路。