结核分枝杆菌DNA聚合酶的结构与功能研究

Among the bacterial species that cause human epidemics, Mybobacterium tuberculosis is particularly successful. It doesn't take too long for M. tuberculosis to evolve out drug-resistant strains since the antibiotics employment became a standard medical treatment for tuberculosis. With the quick spread of various drug-resistant strains of M. tuberculosis, tuberculosis remains a big threat for public health all over the world. Mutation and genome stability loosing are the fundamental reason behind the appearance of drug-resistant M. tuberculosis. Bioinformatic studies have shown that a conserved DNA damage repair system, mismatch repair system does not exist in the M. tuberculosis genome. This striking finding suggests a possibility that the DNA replication system of M. tuberculosis may possess unique structure and function features which allow it to keep its genome stability through other mechanisms. This study focuses on the structure and function of DNA polymerase of M. tuberculosis with the following aims. 1) clone all the subunits of DNA polymerases, express and purify these subunits in order to assemble a functional replication machine in vitro; 2) determine the three dimension structures of DNA polymerase subunits and the holo-enzyme to reveal the structural basis of the biological function of DNA polymerase and the complicated spatial relation and cooperation of the subunits; 3) determine the structure of a special DNA polymerase subunit dnaE2 and evaluate the correlation between the expression level of dnaE2 and mutation rate to reveal the mechanism of drug resistance arising of M. tuberculosis.

随着耐药性结核分枝杆菌菌株的出现和广泛扩散，使结核病重新成为全世界公共卫生的难题之一。病原微生物的耐药性产生与其基因组稳定性的保持密切相关。生物信息学研究表明结核分枝杆菌中缺乏保守的DNA错配修复系统，那么结核分枝杆菌的DNA复制系统是否因为具有结构与功能上的特异性从而可以通过其他机制保持其基因组的相对稳定性呢？本研究以DNA聚合酶为主要对象，开展以下工作：1）通过表达纯化DNA聚合酶的所有亚基、组装成复制机器、检测此系统的DNA合成速率和保真度来揭示结核分枝杆菌聚合酶是如何维护基因组稳定性的？2）通过解析结核分枝杆菌DNA聚合酶的各亚基单体或亚基复合体的三维晶体结构，探讨实现各亚基生物学功能背后的结构基础，以及各亚基之间相互作用的结构基础来揭示DNA聚合酶的具体作用机制；3）通过解析聚合酶dnaE2亚基的结构及评估其表达量变化与基因特异突变产生耐药的相关性来阐明结核分枝杆菌耐药性产生机制

由结核分枝杆菌（Mtb）感染所导致的结核病（TB）仍然是一个重要的全球性的健康威胁。据世界卫生组织报告称，在2013年约有900万人感染结核杆菌，并且有150万人死于结核病。而且，多耐药结核和泛耐药结核的出现、结核菌与艾滋病毒的共感染以及卡介苗的低效率等一系列问题进一步困扰了结核杆菌的预防和治疗。所以，新的抗结核药物的研发变得尤其重要。本项目对结核菌的DNA聚合酶III进行了生化功能研究。.由于结核杆菌的基因组复制是由DNA聚合酶III（DNA pol III）完成的，所以其对结核杆菌的存活和增殖具有重要意义。MtbDNApol III也因此被认为是抗结核药物开发的重要靶点，但是关于其活性机理的研究却并不多。本研究中，我们在E. coli中克隆、表达和纯化了MtbDNApolIII的全部亚基，并用这些亚基在体外重建了由全酶催化的DNA前导链的复制过程。我们研究发现，Mtb α 亚基只有和ε亚基、β clamp以及clamp loader在一起形成全酶以后才会变成一个高效率的DNA复制酶，并且单链结合蛋白（SSB）可以明显提高DNA的复制效率。我们对MtbDNApolIII全酶的体外组装以及由其催化的DNA前导链复制体系的重建为研究MtbDNApolIII的复制机理奠定了基础，同时也为针对MtbDNApolIII全酶的抗结核药物的筛选构建了良好的平台。