促旋酶突变上位相互作用影响结核分枝杆菌氟喹诺酮类药物抗性的分子机理

The scientific issue to be explored in this proposal is: the molecular basis underlying the effect of gyrase mutations epistatic interactions on the Mycobacterium tuberculosis fluoroquinolone resistance.We have some interesting findings previously from the fluoroquinolones resistant clinical M.tuberculosis isolates:both single and double mutations can be involved in the resistance. However, the double mutants being coincidently the combination of single mutants sometimes demonstrated much lower resistance than either single mutation, which defying the explanation by conventional wisdom. We hypothesize there might be a role of epistatic interaction of the double mutations.The role of epistasis might be multiple: DNA gyrase activiy alone or more holistic effect such as fitness cost might be influenced. It is important to define the detailed role involved in the epistasis.Both purified recombinant mutated gyrases and intact clinical isolates or recombinant M.smegmatis will be employed to address this issue. The activity of gyrase, its fluoroquinolones binding capabilites will be tested to define whether the enzyme activity or more comprehensive effect such as fitness cost is engaged for this epistasis. The answer might reveal novel structure-activity relationships of gyrase biochemically,conducive to novel biomarker for the degree of drug resistance to serve the personalized medications. This will inform future optimization of fluoroquinolones.

我们拟回答"促旋酶突变上位相互作用影响氟喹诺酮类药物抗性的分子机理"这一科学问题。此前，我们从中国结核病患者样本中分离的耐氟喹诺酮类药物的结核分枝杆菌中发现了一些促旋酶单突变和双突变。含有这促解旋酶突变体的结核菌的耐药程度差异相当大,单突变菌株的耐药程度有时比含有这两个单突变的双突变菌株显著高。我们猜测：这可能涉及突变位点之间的上位相互作用，而上位相互作用可能影响解旋酶DNA超螺旋活性，也可能影响细菌的适应度等其他方面。具体涉及哪种分子机理则有待研究。我们将采用重组的含有突变的促旋酶进行体外酶活性、药物结合能力分析，以及含有突变酶的重组耻垢分枝杆菌及临床分离突变菌株分析上位相互作用影响耐药性是通促解旋酶活性还是影响适应度等更全面的效应。这将可能从生化层面揭示促旋酶的结构-功能关系，有助于筛选出耐药强弱诊断的新分子标记，指导临床个性化用药，也有助于指导新一代FQ药物的设计和优化。

结核病，尤其是耐药结核病是人类健康的重大威胁。氟喹诺酮类药物是重要的抗生素。促旋酶是其重要靶标。临床耐药分离株的促旋酶存在多个突变，不同的突变位点组合的耐药水平有高有低。本研究旨在探索临床耐药菌株中发现的促旋酶点突变组合对耐药水平高低影响的规律，为了解氨基酸残基水平的突变之间的上位相互作用对耐药的影响分子机理，丰富对上位相互作用机理的认识。促旋酶在微生物中普遍存在，高度保守。氟喹诺酮类药物是广谱抗生素。本研究得到的结果，对于其他耐药细菌的耐药机理的认识也可能会有启发。. 本研究构建了目标位点突变基因、进行了重组表达、纯化了gyrA亚基。建立了酶活性检测方法。在实验方法的建立和等待结果期间，完成了构建了目标位点突变基因、进行了重组表达、纯化了gyrA亚基。建立了酶活性检测方法。纯化、比较了野生型促旋酶两个亚基单独或者组合的酶活、组合的比例对酶活性的影响。在他人基础上，优化了基于CRISPR-Cas12体外高效定点突变多亚基多聚体分子的体系并应用与促旋酶；探索了分枝杆菌噬菌体作为定点突变遗传工具的潜力；发现了影响促旋酶耐药的翻译后修饰。在实验方法的建立和等待结果期间，还完成了下列相关工作： 1. 原核生物第一个蛋白质降解系统组分pafC功能的分析、突变菌株构建； 2. 结核分枝杆菌实验室菌株的全基因组乙酰化翻译后修饰分析； 3. 临床广泛耐药结核菌的琥珀酰基化翻译后修饰研究； 4. 首次证明了Holliday Junction关键酶resolvase参与分枝杆菌氟喹诺酮类药物敏感性，并获得了可望作为增效剂的活性小肽； 5. 获得了结核菌参与宿主相互作用的效应分子。6.结核分枝杆菌酯酶的克隆、表达、纯化和功能研究；7.赖氨酸琥珀酰基化的突变模拟和功能研究；8.万古霉素耐药相关转录因子的研究；9.分枝杆菌噬菌体来源的抗生素增效剂组分研究；10.结核菌戊二酰基化研究；11.结核分枝杆菌PE家族分子的功能研究；12.分枝杆菌噬菌体与宿主相互作用的分子鉴定。在涉及促旋酶耐药相关的蛋白质翻译后修饰方面，做了比较系统的探索性工作。这些工作目前已经发表标注本项目编号的SCI论文20篇。标书中的科学目标基本完成。产出指标超额完成。直接关于促旋酶突变影响酶活性和耐药性的结果还在整理中。