益气活血法对脑出血后血管新生启动机制的影响研究

在两个NSFC课题工作基础上，本项目从HIF-1α转录后调控的角度，研究益气活血法对thrombin启动脑出血(ICH)血管新生的影响。内容：第一部分：免疫组化结合LCM从注射thrombin的鼠脑获得HIF-1α阳性微血管，miRNA array结合软件数据分析确定HIF-1α阳性微血管的miRNAs差异表达谱；MAMI预测差异表达谱中以HIF-1α为靶标的miRNA；萤光酶双报告基因质粒构建、转染、酶活性检测，验证、确定thrombin改变表达的，血管内皮细胞内以HIF-1αmRNA为靶标的miRNAs。第二部分：LNA-ISH、免疫组化等组织学技术和分子生物学技术评价自体血诱导ICH鼠脑miRNAs、HIF-1α表达、血管新生变化和miRNA inhibitor的干预作用。意义：通过研究ICH血管新生的启动机制，进一步揭示益气活血法的作用环节，为该治法的现代研究提供新的思路。

研究背景与目的：脑出血（intracerebral hemorrhage, ICH）的致残率、死亡率很高，但目前尚无有效治疗方法。ICH属中医“中风”范畴，气虚血瘀是ICH后的基本病机之一。补阳还五汤是益气活血治疗中风的名方。本课题组前期工作已证实ICH脑内存在血管新生，且益气活血法可以通过干预血管内皮细胞的增殖调控，促进微血管形成。但上述研究并未涉及ICH后血管新生的启动机制。现已证实ICH后从血肿侵入周围组织的凝血酶（thrombin）能启动血管新生，提高 HIF-1α 的蛋白水平，但不改变HIF-1α mRNA水平。本项目拟从转录后调控改变HIF-1α表达的角度，研究益气活血法对thrombin 启动ICH后血管新生机制的影响。.内容与结果：在进一步证实凝血酶通过调节血肿组织HIF-1α,VEGF, Ang-1, Ang-2表达，启动血管新生后，以对侧脑组织作为对照，TaqMan® Array MicroRNA Cards 高通量检测结合miRNA靶基因预测主流数据库筛选出Thrombin启动血管新生时差异表达的 miRNAs；细胞水平候选miRNA验证提示：miR-24和let-7a能与靶基因脯氨酰羟化酶(PHD1, HIF-1α降解酶)识别并结合，并发挥降低靶蛋白水平的效应。采用免疫组化结合激光显微切割技术获取自体血模型大鼠鼠脑 vWF 阳性微血管，证实以补阳还五汤为代表的益气活血法能通过进一步上调ICH后miR-24和let-7a水平、抑制PHD1，从而提高HIF-1α表达，促进血管新生和神经功能的恢复，上述效应可被thrombin抑制剂hirudin阻断。miRNA功能评价提示：ICH后抑制miR-24或let-7a可在转录后调控水平上调PHD1表达，从而抑制血管新生，阻碍神经功能的恢复。.结论：以上研究证实以补阳还五汤为代表的益气活血法可能通过改变ECs内以PHD1 mRNA为靶标的miR-24 和 let-7a的表达，从而减少HIF-1α的降解，调节ICH后thrombin启动的血管新生机制。