衣原体噬菌体Vp1粘附沙眼衣原体后的抑制效应及其机制的研究

Chlamydia trachomatis urogenital infection is the most common sexually transmitted disease (STD) all over the world in recent years, which has many complications, prolonged refractory and lack of effective vaccines. The latest international thought is that Chlamydia phage is expected to serve as an effective means to solve this problem, but have not yet been found it in C.t. Our prior study (National Natural Science Foundation: 30671879) discovered that patients with Chlamydia trachomatis genitourinary tract infection have serum anti-phage Vp1 antibody-positive, nucleic acid amplification on Chlamydia phage Vp1 of patients' secretions specimens retained in laboratory were positive. We present evidence suggesting that Vp1 protein preliminarily built has inhibiting effect on Chlamydia trachomatis and initially identified binding site to Chlamydia trachomatis is Pmp-I (polymodal membrane protein-I). This project contemplated maximizing the effect of VP1 protein specific binding and inhibition to Chlamydia trachomatis, constructing and screening the bacteriophage protein which has optimal inhibiting or even eliminating effects on Chlamydia trachomatis by further confirming the binding capacity and possible inhibiting effects of VP1 protein to 8 types of Chlamydia trachomatis, analysising the latter's membrane specific binding sites and the readjusting the sequence and configuration of VP1 protein based on our prior studies. We simultaneously utilize the theory of signal transduction、apoptosis and autophagy, combined with electron and confocal microscopy to explore the inhibition mechanism of bacteriophage VP1 protein.

沙眼衣原体泌尿生殖道感染是近年来国内外最常见、并发症众多、迁延难治、疫苗乏效的性传播疾病。国际上新近认为衣原体噬菌体有望作为解决这一难题的有效手段，但目前尚未发现沙眼衣原体的噬菌体。课题组前期研究（国家自然基金：30671879）发现沙眼衣原体泌尿道感染病人的血清抗噬菌体Vp1抗体阳性，病人分泌物标本衣原体噬菌体Vp1核酸扩增阳性，并发现我们初步获取的Vp1蛋白对沙眼衣原体有抑制作用,在沙眼衣原体膜表面有特定的结合部位-多形态膜蛋白I(PmpI)。本课题拟在前期基础上，进一步确证Vp1蛋白对8型沙眼衣原体的结合能力和可能的抑制作用，分析沙眼衣原体膜表面的特异性结合位点，重新调整Vp1的序列和构型，试图达到特异结合与特异抑制效应的最大化，构建筛选出对沙眼衣原体有良好抑制/清除作用的噬菌体蛋白。同时用信号传导、凋亡、自噬,结合电子和共聚焦显微镜，探讨噬菌体Vp1蛋白的抑制机制。

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, C.t)泌尿生殖道感染是近年来国内外最常见、并发症众多、迁延难治、疫苗乏效的性传播疾病，是国际疾病控制的热点和难点。.在该基金的资助下，我们发现ФCPG1的Vp1蛋白对细胞培养的8种血清型C.t均具有显著的生长抑制和破坏作用，并已在小鼠生殖道C.t感染模型中验证。不仅同C.t原体孵育使C.t生长受抑制，并且C.t培育增殖24小时后再加入Vp1也获得了同样明显减少C.t数量的效果，这种抑制/破坏效果在拟C.t噬菌体Vp1蛋白优化重组后可达65%-92%。Vp1蛋白对Hela细胞、McCoy细胞没有毒副作用，也不抑制其他生殖道常见菌的生长，说明Vp1蛋白对C.t的抑制作用是特异的，可能触发了某条信号通路使C.t生长周期抑制甚至发生程序化死亡，而不是传统的噬菌体在其宿主细菌内增殖导致的破坏裂解。为了分析Vp1的关键活性位点课题组将Vp1蛋白进行截短克隆表达，发现Vp1主要作用位点可能在158-330区间内，并且在330-502区间内有较弱的辅助位点，此两位点互相辅助共同完成Vp1蛋白对C.t的抑制。IN5环（第216-299位氨基酸）是暴露在Vp1蛋白表面的插入环，推测其可能是潜在的受体结合区域，与噬菌体对宿主的黏附、植入和识别有重要关系。课题组表达并纯化了IN5环区域蛋白，发现其对C.t生长有明显的抑制作用但弱于Vp1。课题组前期研究发现C.t表明的PmpI蛋白是Vp1的接头蛋白。为了探索触发点PmpI下游抑制性信号通路的蛋白，课题组对Vp1孵育作用前后的C.t始体进行蛋白非标定量，分析得出Vp1作用前后的差异蛋白，表达降低的蛋白80个、表达升高的蛋白36个。其中，与信号传导有关的双组份传导系统、3型分泌系统蛋白以及蛋白水解酶水平升高。我们发现C.t感染宿主细胞后的第48小时，Vp1干预组衣原体死亡相关蛋白的mRNA水平是未干预组的2.83倍。我们推测，Vp1结合C.t膜表面的PmpI蛋白之后，PmpI构象发生变化，将信号传递给C.t内的双组份传导系统或3型分泌系统，从而激活衣原体死亡相关蛋白和多种蛋白水解酶，引发反向自身破坏，发生类似真核生物的“凋亡”，最终产生我们观察到的生长抑制和破坏现象。我们对C.t抑制性信号通路的研究，将为探索比大肠杆菌更低等的微生物内是否存在类似的死亡相关信号通路提供重要参考。