重组噬菌体对沙眼衣原体作用及机制的探索

Chlamydia trachomatis urogenital infection is the most common sexually transmitted disease all over the world in recent years, which has many complications, prolonged refractory and lack of effective vaccines. The latest international thought is that Chlamydia phage is expected to serve as an effective means to solve this problem, but have not yet been found it in C.t.Our research group (National Natural Science Foundation 30671879) discovered that the optimized GPIC phage Vp1 with host recognition function could bind in Chlamydia trachomatis polymorphic membrane protein I (Pmp I) specifically and produced inhibition of Chlamydia trachomatis .And detected Chlamydia phage Vp1 nucleic acid fragment in patient secretion samples of Chlamydia trachomatis infection in our lab. This thesis intends to rebuild new engineered-phages using the Vp1 and the differential phages. And using anti Vp1 monoclonal antibody developed early made in our Lab and the phage labeled material, combined with fluorescence, colloidal gold labeling, immune electron microscopy and confocal microscopy, to observe the 12 phages we construct biomembrane and cellular permeability and the growth, reproduction and distribution in the life cycle of Chlamydia trachomatis, and to find the relationship between phage grow with inhibition, destruction of the host Chlamydia trachomatis, to explore this phage possible action mechanism on Chlamydia trachomatis.

沙眼衣原体泌尿生殖道感染是国内外最常见的性传播疾病，可引起严重并发症。很多病人迁延难治，也没有有效的疫苗。国际上新近认为衣原体噬菌体可能是最有希望的生物治疗手段，但迄今国内外尚未发现沙眼衣原体噬菌体。课题组前期研究（国家自然基金30671879）发现具有宿主识别功能的优化GPIC噬菌体Vp1蛋白可特异结合在沙眼衣原体多形态膜蛋白I（Pmp I）上，产生抑制效应，并在沙眼衣原体感染患者的分泌物标本中检测到衣原体噬菌体Vp1核酸片段。本课题拟在前期基础上用上述两种Vp1片段与不同类别噬菌体重组，应用本实验室前期研制出的抗Vp1单克隆抗体和各噬菌体标记物质，结合荧光、胶体金标记，在免疫电镜和共聚焦显微镜下，观察我们构建的12种噬菌体的透膜能力、在沙眼衣原体各生活周期中的生长繁殖和分布，以及宿主沙眼衣原体被抑制、破坏的关系，探讨噬菌体对沙眼衣原体可能作用机制。

沙眼衣原体( Chlamydia trachomatis, C.t )泌尿生殖道感染是近年来国内外最常见的性传播疾病，抗生素耐药与持续感染报道屡见不鲜，由于治疗效果欠佳、缺少有效疫苗，探索对C.t有治疗作用的生物治疗手段成为研究的热点。. 在该基金的资助下，我们将VP1蛋白进行截短克隆表达，发现VP1主要作用位点可能在158-330位氨基酸区间内，是 VP1蛋白对C.t抑制的关键部位，其中IN5环（第216-299aa）是暴露在VP1蛋白表面的插入环，推测其可能是潜在的受体结合区域，与噬菌体对宿主的黏附、植入和识别有重要关系，表达并纯化了IN5环区域蛋白，用其干预C.t培育过程，发现其对C.t生长的抑制率达52.24%。课题组利用基因重组技术，以M13噬菌体为载体，将IN5片段与M13噬菌体重组，酶切、PCR、测序、Western 印迹显示，IN5 片段成功连接至 M13 噬菌体，并表达融合蛋白。同时合成了能稳定表达整合素结合蛋白（RGD）和IN5环的M13-RGD-IN5构建体，该构建体为有沙眼衣原体识别能力的活性拟衣原体噬菌体，CCK8检测其对细胞无明显毒性，RGD增加噬菌体穿透细胞膜及包涵体膜的能力，共聚焦显微镜观察噬菌体在Hela细胞中的位置，发现衣原体的荧光和噬菌体荧光存在很大程度的重叠，提示噬菌体不仅进入细胞，而且进入衣原体包涵体内。M13-RGD-IN5重组体对C.t感染的抑制率达69.4%,其机制可能系衣壳蛋白中表达的IN5蛋白促进重组噬菌体与C.t识别，加速噬菌体对衣原体的侵袭过程，噬菌体引起网状体停止分裂，不能产生新的原体，从而导致衣原体感染率降低。课题组还利用衣原体穿梭质粒技术将合成的PhiCPG1噬菌体全基因片段与衣原体部分质粒序列重组，获得了具有生物活性重组噬菌体，能够抑制沙眼衣原体的生长。已将合成的PhiCPG1噬菌体基因片段环化，正在将环化的PhiCPG1DNA转入衣原体内，以期获得有活性的天然噬菌体。 . 经仔细操作合成的重组噬菌体将为发病率极高的C.t感染提供精准特异、有效、没有副作用且不影响人体微环境的生物治疗手段，避免了长期应用抗菌素产生耐药性，为解决持续性沙眼衣原体感染临床难题奠定基础，也为控制其他性传播病原体提供了一种模型。