PmpI-TCS/T3SS作为可能的信号通路介导噬菌体Vp1蛋白抑制/破坏沙眼衣原体机制的探索

Chlamydia trachomatis urogenital infection is the most common sexually transmitted disease in the world. Protracted Chlamydia trachomatis urogenital infection, which is international hotspots and difficulties, has many complications and lack of effective vaccines. We previously found that the suppression / destruction rate of Phage capsid protein Vp1 against chlamydia reached 65%-92%. Vp1 can promote the genital tract Chlamydia clearance in mouse model. The inhibition of Chlamydia by single Vp1 protein is so obvious that the mechanism is not the mechanical lysis of bacteriophage, but a special pathway induce the similar "apoptosis" phenomenon. So far there is no report on the related signaling pathways. Furthermore we found that the PmpI protein of the outer membrane of Chlamydia trachomatis is the trigger point of the inhibitory signal pathway resulting in elevated levels of TCS and T3SS after Vp1 binding. Therefore, we hypothesize that this pathway led to reverse self destruction of Chlamydia trachomatis by CADD and proteolytic enzyme. The purpose of this study is to disclose the relationship between PmpI, TCS and T3SS and the changes of the protein level after Chlamydia repressed, elucidate the inhibitory signal pathway, search for the inhibitory effect of marker proteins and explore the ‘apoptosis’ mechanism in chlamydia by using the shuttle plasmid and Group II Intron technology, combined with protein mass spectra ,immunoelectron microscopy analysis of different time point and bioinformatics method.

沙眼衣原体泌尿生殖道感染是近年来国内外最常见、并发症众多、迁延难治、疫苗乏效的性传播疾病，是国际疾病控制的热点难点。我们前期发现噬菌体衣壳蛋白Vp1对衣原体特异抑制率达65%-92%，并在小鼠生殖道衣原体感染模型中验证。单一蛋白对衣原体抑制如此明显，说明其抑制机制并非以往噬菌体机械性裂解而是通过未知信号通路诱发产生类似凋亡的现象。我们进一步发现衣原体表面的PmpI是该通路触发点，Vp1结合后导致衣原体TCS和T3SS水平升高。进而推测Vp1作用于PmpI的信号通过TCS或T3SS传达，最终激活衣原体死亡相关蛋白(CADD)和蛋白水解酶反向破坏自身。本课题旨在前期基础上运用穿梭质粒和Group II Intron技术，结合抑制后不同时相免疫电镜、蛋白质谱和生物信息学分析等，研究衣原体及其蛋白变化与PmpI、TCS、T3SS的关系，阐明抑制性信号通路、发现抑制效应标志、探索衣原体“凋亡”机制。

沙眼衣原体泌尿生殖道感染是近年来国内外最常见、并发症众多、迁延难治、疫苗乏效的性传播疾病，是国际疾病控制的热点难点。我们前期在上一项国自然面上项目（31370211）资助下，发现噬菌体衣壳蛋白Vp1对衣原体特异抑制率达65%-92%，而这种抑制机制不是传统的噬菌体机械性裂解的机制，可能是一种新的途径。我们推测是通过未知信号通路诱发产生类似凋亡的现象。在本课题的资助下，我们对衣原体凋亡及其信号通路进行了艰苦的探索。由于迄今为止凋亡明确发生在真核细胞生物，在原核细胞尚未发现凋亡及其信号通路。即使在研究最透彻的大肠杆菌也只是发现了类似凋亡的雏形和可能的几条信号通路。我们发现Vp1结合衣原体表面的PmpI后导致衣原体TCS和T3SS水平升高，进而衣原体死亡相关蛋白(CADD)，最终导致衣原体的破坏自身。我们采用Western Blot方法检测各实验对照组之间ERK信号通路p-ERK1/2及总ERK1/2的变化情况；采用Realtime-PCR方法检测各组之间ERK1及ERK2基因的变化情况，确定衣原体内部不存在这些真核细胞通常的关键信号通路。我们通过PmpI 多克隆抗体封闭沙眼衣原体表面的 PmpI 蛋白和阻遏衣原体死亡相关蛋白（CADD）之后，明显地影响了Vp1 蛋白对沙眼衣原体的抑制作用。说明 CADD 可能是信号通路末端的效应因子，其对沙眼衣原体自身产生了反向破坏作用。T3SS中，Vp1 的干预使沙眼衣原体 incA 的转录水平升高，而大部分T3SS 包括HctA（CT743）、HctB（CT046）、OmcA（CT444）、OmcB（CT443）在衣原体生长后期的后期下降，从而支持衣原体产生了抑制和破坏作用。.由于衣原体微小而且在细胞内存活，我们还没完整获得这些信号的关联。我们在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌这两个重要又相对机制清楚的病原菌中试图找到如同衣原体这样的噬菌体蛋白的抑制作用的蛋白。除了扩展这种新的治疗途径外，阐明其作用机制，也是我们另一个重要的目的。其结果有可能是在明年毕业的我的两个博士研究中呈现。本课题结余经费也是为此进一步实验和发表文章准备。