衣原体噬菌体衣壳蛋白Vp1受体的分离鉴定及其结构功能研究

沙眼衣原体(C.t)泌尿生殖道感染是近年来国内外最常见、并发症众多、迁延难治、疫苗乏效的性传播疾病。国际上公认衣原体噬菌体有望成为解决这一难题的有效手段，但目前尚未发现沙眼衣原体噬菌体。课题组前期研究发现我们构建的豚鼠结膜炎衣原体噬菌体Vp1蛋白对C.t生长有明显抑制作用，且C.t外膜中有其特异性的受体。本课题计划表达受体PmpI羧基端肽段和蛋白全长（氨基端已表达），分别免疫家兔产生特异性抗体后用免疫亲和层析从C.t中分离受体PmpI,通过蓝绿温和胶及电镜观察其空间结构；将Vp1作用C.t后，免疫共沉淀验证二者的结合，密度梯度离心纯化C.t，二维电泳、质谱分析和定量PCR检测Vp1作用后C.t中差异表达蛋白及其基因，根据差异表达蛋白的功能得出Vp1和受体结合介导C.t生长抑制的信号途径。本项目的完成有望得到PmpI的空间结构并阐明其介导C.t生长抑制的机制，为C.t感染的治疗找到新的靶点。

近年的研究发现豚鼠结膜炎衣原体噬菌体Vp1蛋白对沙眼衣原体生长有抑制作用，且Vp1蛋白能够和沙眼衣原体外膜蛋白PmpI的氨基端蛋白结合，但二者结合后如何抑制衣原体的生长，以及受体PmpI的结构都尚未明了。课题组在前期实验的基础上，经过生物信息学分析PmpI的基因序列，分段设计了针对PmpI的克隆引物，构建了PmpI全长和羧基端的表达载体，表达了相应的PmpI全长蛋白和羧基端蛋白，并免疫产生了相应高效价的多克隆抗体。生物信息学技术分析显示PmpI具有跨膜自转运蛋白结构，与 大肠杆菌O157:H7的膜蛋白EspP具有相似的晶体结构。在此基础上，进一步发现Vp1蛋白能够和PmpI全长蛋白和PmpI蛋白氨基端结合，而不与PmpI蛋白羧基端结合，说明Vp1蛋白在PmpI中的结合位点在蛋白的氨基端。将Vp1蛋白作用于沙眼衣原体后，密度梯度离心纯化衣原体，二维电泳、iTRAP分析检测差异表达蛋白已经完成实验，获得了重要的结果，但部分实验还需进一步验证，以及出于保密的原因，暂不公开相关的实验结果。此外，课题组紧跟衣原体研究领域的国际最新进展，将最新的衣原体转化技术引入国内，结合本项目的相关内容，构建了pgp3的原核表达载体，诱导表达pgp3蛋白并免疫小鼠产生多克隆抗体，进一步构建了pgp3和pgp4基因删除的衣原体突变体，Western印迹和RT-PCR检测发现pgp3的基因表达受到pgp4的调控，解释了与衣原体生长繁殖有关的pgp3基因的调控机制。. 课题组按计划基本完成本项目的内容，获得了重要的实验资料和结果，在《中华微生物学和免疫学杂志》、《中华传染病杂志》和《中华皮肤科杂志》等杂志发表论文4篇，培养博士研究生1名，硕士研究生3名。