SAG通过GLI1调控SF1促进睾丸间质干细胞分化治疗男性迟发性性腺功能减退症的实验研究

The Late-onset Hypogonadism in males (LOH) seriously affects the health of old men, and there is a large side effect in conventional drug therapy. The decrease in the number of Leydig cells (LCs) is the core mechanism of LOH. In our previous study, we found that small molecule compound SAG could promote the differentiation of Stem Leydig cells (SLCs) to LCs in old LOH mice. However, the mechanism of SAG to promote the differentiation of SLCs has not been elucidated. It is known that SAG activates GLI1 transcription, and the expression of steroid generating factor (SF1) is a key step in the differentiation of SLCs into LCs. Our pre experiment suggests that GLI1 can directly regulate SF1 transcription. This project proposed by GLI1 gene knockout and overexpression experiments, intratestis injection SAG treatment of LOH mice, in order to obtain reliable evidences of GLI1 regulating SF1 expression, revealed that SAG regulates the expression of SF1 is the molecular mechanism of SAG promote the differentiation of SLCs into LCs, and expounds the safety and efficacy of SAG treatment of LOH, reveals SAG promote the differentiation of endogenous SLCs to LCs is the treatment mechanism of intratesticular injection of SAG in the treatment of LOH, to provide the scientific basis and lay the foundation of the new therapy for SAG treating LOH.

男性迟发性性腺功能减退症（LOH）严重影响老年男性健康，常规药物疗法存在副作用大等缺陷。睾丸间质细胞（LCs）数量减少是LOH核心发病机制。我们前期研究发现小分子化合物SAG可促进老年LOH小鼠睾丸间质干细胞（SLCs）向LCs分化。但SAG促进SLCs分化的机制尚未阐明。已知SAG可激活GLI1转录，类固醇生成因子（SF1）表达是SLCs分化为LCs的关键步骤。我们预实验提示GLI1可直接上调SF1转录。本项目拟进一步通过GLI1基因敲除和过表达实验、睾丸内注射SAG治疗LOH小鼠等实验，旨在获得GLI1调控SF1表达的可靠证据，揭示SAG通过GLI1调控SF1表达是SAG促进SLCs分化为LCs的分子机制，并阐明SAG治疗LOH的有效性和安全性，揭示SAG促进内源性SLCs分化为LCs是睾丸内注射SAG治疗LOH的治疗机制，为SAG治疗LOH的新疗法提供科学依据和奠定实验室基础。

男性迟发性性腺功能减退症（LOH）严重影响老年男性健康，常规药物疗法存在副作用大等缺陷。睾丸间质细胞（LCs）数量减少导致睾酮下降是LOH核心发病机制。我们前期研究和其他学者研究表明，DHH信号通路激动剂SAG可在体外促进睾丸间质干细胞（SLCs）向LCs分化；SAG可激活GLI1转录；类固醇生成因子（SF1）表达是SLCs分化为LCs的关键步骤。但是，SAG促进SLCs分化的机制尚未阐明，SAG治疗LOH的有效性和安全性尚未知晓。因此，我们研究了在SLCs中GLI1对SF1表达的调控作用。我们在SLCs中过表达GLI1，发现SF-1的转录和表达水平升高。我们采用CHIP试验对GLI1结合序列进行分析，发现SF-1的启动子序列存在于Gli1蛋白的DNA结合片段中。我们在过表达GLI1的SLCs中导入SF-1启动子荧光素酶报告基因系统pGL3-Sf-1(-4900)，通过双荧光报吿素酶实验表明Gli1蛋白可直接结合SF-1基因的启动子部位，进而促进SF-1的转录。我们揭示了SAG通过GLI1上调SF1表达是SAG促进SLCs分化为LCs的重要分子机制。接着，我们利用老年LOH小鼠疾病模型研究SAG对LOH的治疗作用。我们对实验组小鼠行睾丸内注射SAG，对照组行睾丸内注射生理盐水，在治疗前后检测血清睾酮水平、睾丸内SLCs和LCs数量、睾丸组织染色评估生精功能、拉力和耐力行为学检测、观察睾丸炎症感染和成瘤等并发症情况，发现实验组和对照组无明显差异。我们研究结果表明老年小鼠睾丸内注射SAG对SLCs分化没有影响，睾丸内注射SAG疗法不能有效治疗LOH。我们发现通过SAG在体外促进人SLCs分化为LCs，可以获得大量有分泌睾酮功能的LCs。用海藻酸-聚赖氨酸-海藻酸盐（APA）包裹LCs制备成LCs-APA微球囊，注射到切除睾丸小鼠的腹腔中。发现LCs可以在微球囊中存活并分泌睾酮，没有免疫排斥，可以提高血清睾酮水平，还改善了肌肉萎缩等睾酮缺乏症状。LCs-APA微球囊移植疗法有希望成为治疗LOH和睾酮缺乏疾病的新方法。