KLF4调控uPAR在肝细胞癌发生上皮-间质转化中的作用和机制研究

KLF4是细胞保持上皮表型的关键因子，缺失可致肿瘤细胞发生上皮-间质转化（EMT）而获得侵袭和转移能力。本课题组首次观察到肝细胞癌（HCC）中存在KLF4表达缺失，该变化可影响HCC迁移和侵袭能力，进一步观察到KLF4负性调控uPAR，后者已证实可促进肿瘤细胞EMT。本课题拟首先采用CHIP和EMSA技术明确KLF4通过与uPAR启动子结合发挥调控作用的机制，进一步从分子和细胞水平对KLF4下调可否导致HCC发生EMT进行探讨，采用siRNA和基因转染技术对其通路中uPAR及其下游的uPA,MMP在其中的关键作用展开深入研究，对同样受KLF4调控并参与EMT过程的E-cadherin与uPAR的关系进行研究。最后采用高转移肝癌裸鼠模型和HCC临床组织标本验证KLF4及其下游基因对EMT的调控作用和调控网络，阐明KLF4缺失可促使HCC发生EMT改变，并因此使HCC获得侵袭和转移能力。

KLF4是细胞保持上皮表型的关键转录因子，其缺失可致肿瘤细胞发生上皮-间质转化（EMT）而获得侵袭和转移能力。KLF4已被报道在多种肿瘤中发挥抑癌作用，然而KLF4在肝癌中的功能还不清楚。本课题组利用分子生物学，细胞生物学和组织化学等手段首次研究了KLF4在肝癌发生中的作用，并发现了一个KLF4下游的效应靶点uPAR受到KLF4抑制从而介导KLF4的抑癌作用。实验结果显示，多种肝癌细胞株中过表达KLF4负向调控uPAR表达，双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀实验证实KLF4直接结合uPAR启动子区域直接抑制uPAR转录。体外细胞学功能实验证实过表达KLF4抑制肝癌细胞迁移，在形态和分子水平抑制细胞EMT；RNAi干扰下调KLF4表达后，EMT过程间质型标记蛋白水平显著升高。uPAR敲减后，KLF4对细胞迁移的抑制作用消失，表明KLF4抑制细胞迁移通过抑制uPAR来实现。动物模型试验也证实KLF4对肝癌细胞皮下成瘤及癌细胞肺转移的抑制作用；所成瘤体组织免疫组化分析也发现EMT的分子标记蛋白与KLF4的表达密切相关，进一步证明KLF4对癌细胞转移和EMT的抑制作用。最后在临床样本中，我们观察到KLF4无论mRNA还是蛋白水平在癌组织中表达均下调或缺失，在肝癌细胞中KLF4也呈低表达模式；与之对应的是uPAR表达和KLF4表达存在明显的负相关，侧面证明KLF4对uPAR的负向调控作用；通过对临床样本病人资料的分析统计，结果表明KLF4表达与病人预后生存期、瘤体大小和TNM分期都有明显的统计学意义，提示KLF4缺失或低表达可能是促使肝癌发生EMT改变并转移的潜在机制。我们的研究结果阐明了一种肝癌发生和转移的新机制，并为抗肿瘤的药物研发和筛选提供了理论依据，具有重要的应用价值。