GnRH基因异位表达治疗低促性腺激素性性腺功能减退症实验研究

低促性腺激素性性腺功能减退症的发病机制是由于下丘脑完全或部分丧失合成、分泌GnRH的能力或合并有嗅球发育不全。能分泌GnRH的神经核团位于下丘脑弓状核，本课题采用立体定向外科结合MRI三维高分辨率技术以下丘脑弓状核为中心进行靶向照射，采用"阶梯剂量"照射模式，以筛选出"低促性腺激素性性腺功能减退症"SD大鼠模型。化学合成GnRH基因并构建成转移质粒，体外扩增该质粒后与慢病毒载体共同构建成重组慢病毒，体外感染下颌下腺原代培养细胞观察目的基因表达，将重组慢病毒导入能表达GnRHR的下颌下腺实质内并检测GnRH基因表达及GnRH多肽分泌，同时监测外周血FSH、LH、T等性激素水平的变化规律。本研究所建立的"低促性腺激素性性腺功能减退"SD大鼠模型，为进一步研究该疾病提供便捷的平台。该研究采用的基因异位表达、分泌治疗因某种基因功能完全或部分丧失疾病的途径，为治疗其他内分泌疾病开拓新思路。

低促性腺激素性性腺功能减退症是指由于下丘脑-垂体功能障碍，使得促性腺激素释放激素(GnRH)和(或)促性腺激素(GTH)缺乏，导致睾丸功能低下，而垂体其他功能正常，常见的包括Kallmann综合征、特发性低促性腺激素性性腺功能低下(IHH)等。其发病机制是下丘脑完全或不完全丧失合成分泌促性腺激素释放激素的能力。目前有关该疾病的研究多局限于临床资料分析，有关基础研究甚为匮乏，对该疾病的病理、生理等分子生物学研究以及有效地治疗措施缺乏研究。本研究旨在采用立体定向外科结合MRI三维高分辨率技术以下丘脑弓状核为中心进行靶向照射，采用“阶梯剂量”照射模式，以筛选出“低促性腺激素性性腺功能减退症”SD大鼠模型，建立一个稳定的动物模型对低促性腺激素性性腺功能减退症进行研究。本研究选择青春前期21天（PND 21）SD（Sprague-Dawley）雄性大鼠40只随机分为4组。将大鼠头部固定于LeksellG型立体定向架，术前用MRI行颅内三维扫描精准定位下丘脑弓状核，以此为靶点行γ刀放射以破坏分泌GnRH多肽的神经元核团。靶点中心剂量分别为30Gy、20G和10Gy对其中三组分别进行照射，第4组空白对照不做处理。术后每天观察动物的摄食、排泄、外观、行为和运动等一般情况；每两周行一次体重、睾丸大小测量；每两周行一次性激素全套检查；行精子密度、活率、活力检查；行睾丸苏木紫-伊红染色，观察睾丸显微结构。本研究结果发现不同剂量立体定向外科手术可引起大鼠睾丸重量、睾体比值下降（P＜0.05），降低程度与大脑照射剂量呈正相关；三组不同剂量立体定向外科手术均可引起大鼠精子密度减少（P＜0.05），而大鼠精子活率及精子活力均无明显影响；不同剂量立体定向外科手术对大鼠睾丸显微结构无明显影响。通过本研究发现不同照射剂量手术的大鼠睾丸体重、睾体比值、精子密度均有改变，且与“低促性腺激素性性腺功能减退症”疾病的临床及诊断基本相符合，因此证实该研究模型已经创建出成功，为后续该疾病的诊断、治疗研究提供了实验支持。