人类卵巢癌中双微体相关6p22.3扩增区候选基因AK097585的鉴定与功能分析

Double minute chromosomes(DMs) is a major sign of gene amplification on extra chromosome, and closely related to tumorigenesis, development, drug resistance and prognosis. Our previous studies demonstrated that the region of chromosome 6p22.3 amplified in the form of DMs in ovarian cancer cells. No related reports showed the 6p22.3 region had any functional gene in the current database, suggesting that the region may have correlation function genes in the tumorgenesis and tumor development, at the same time through the biological information in the human genome database for this region, the study found DNA gene sequence in the region with the transcriptional activity. Study on its biological functions will be helpful to find new oncogene and explore new molecular markers of tumor. This experiment will be through mRNA sequence acquisition, functional prediction and conserved sequence search to annotate the gene function, then in the model cell lines by gene expression and knockdown to verify its biological function; through bioinformatics prediction to find and verify the related factors to the gene expression and regulation; finally, through analysis of the correlation between the gene expression and tumor development in a large scale clinical tissue samples reveals the molecular function of the double minutes related gene and its practical value in clinical diagnosis and treatment.

双微体是染色体外基因扩增的主要细胞遗传学标志，与肿瘤的发生、演进、耐药及预后密切相关。本课题组前期实验证实卵巢癌细胞中6p22.3以双微体形式发生扩增，提示可能有与肿瘤进展相关功能基因存在，而目前该区域在数据库中仅有具备转录活性的AK097585基因DNA序列信息。本项目中，首先通过mRNA全序列捕获，功能预测及同源保守序列搜索对该基因功能进行注释，随后在模式细胞系和卵巢癌细胞系中通过基因表达及敲除技术对其生物学功能进行验证；通过生物信息学预测该基因表达调控相关因子并进行验证；预测该基因启动子序列并构建荧光报告载体分析双微体上其他高扩增转录因子与AK09758基因的相互调控关系；最后，在大规模临床组织样品中对其肿瘤发生发展相关性进行分析，全面揭示该双微体相关基因的分子生物学功能及其在临床诊断和治疗中的实用价值，探索新的癌基因及肿瘤分子标记物。

本研究目的在于探讨在人卵巢癌细胞株UACC-1598中双微体携带的6p22.3高扩增区域上的lncRNA-AK097585的功能，明确lncRNA-AK097585与双微体之间的关系。本研究首先利用Real-Time PCR方法检测了多种肿瘤细胞系中AK097585的扩增和表达情况；利用多种组织芯片检测AK097585在肿瘤组织样本及对照样本中的表达水平；之后分别选择过表达与RNAi技术对AK097585进行沉默和过表达，随后利用MTS方法检测细胞增殖水平。最后利用TCGA在线数据库中卵巢肿瘤的样本筛选含双微体或均质染色区以及不含双微体或均质染色区的样本，及样本中双微体或均质染色区所在的高扩增区域。利用TANRIC网站数据检测双微体或均质染色区上携带lncRNA在组织中的表达水平，并进行功能募集分析，探讨双微体相关lncRNA对于肿瘤发生发展的作用。我们发现AK097585在肝癌、结肠癌的癌与癌旁组织中存在表达差异，癌组织表达水平均高于癌旁组织。沉默lncRNA-AK097585后卵巢癌细胞UACC-1598的增殖水平升高，单独过表达AK097585对于无双微体卵巢癌细胞OVCAR3的细胞增殖无影响。这说明lncRNA-AK097585对含双微体的卵巢癌细胞株的增殖水平起到抑制作用，但对无双微体细胞株无影响。利用TCGA数据库基因芯片数据，设定含有双微体或均质染色区的样本条件，我们在834例卵巢癌样本中筛选得到29例含双微体或均质染色区的样本以及18例不含双微体或均质染色区的样本。对含有双微体或均质染色区的29例样本进行高扩增区域分析得到80种lncRNA。对高扩增区域的lncRNA进行GO募集分析发现其参与多种生理过程、调控细胞周期并与肿瘤相关通路有关。对29例含双微体或均质染色区的样本以及18例不含双微体或均质染色区的样本中存在差异表达的561个lncRNA进行GO募集分析发现其功能多集中于RNA合成、转录和代谢过程。本研究发现在双微体上存在lncRNA，而且lncRNA对双微体的存在和发展起到一定的作用，这也为双微体相关的lncRNA在临床诊断方面提供了新的靶向。