胃癌NCI-N87细胞双微体的染色体起源、扩增子及其表达基因鉴定

双微体（double minute chromosomes，DMs）是细胞中成对、自主复制、无着丝粒、无端粒的额外染色体成分，是基因扩增的主要细胞遗传学标志。基因扩增是细胞原癌基因激活成癌基因的重要途径，靶基因扩增及过表达为细胞提供选择生长优势，可导致细胞无限增殖形成肿瘤。DMs出现于多种类型的肿瘤细胞和耐药细胞中，与肿瘤发生发展及耐药密切相关。本课题在前期实验基础上，针对DMs与胃癌的关系，拟采用染色体显微切割分离人胃癌NCI-N87细胞的DMs，构建DM DNA文库；利用PFGE电泳、Southern 印记杂交及FISH等技术鉴定DMs大小及其染色体来源；确定DMs上扩增子数目及其边界，分析扩增子所含基因及其表达。确定DMs上胃癌相关的扩增基因及基因组不稳定的热点序列，为揭示DMs在胃癌中的作用，为肿瘤中DMs存在的机制研究提供新思路，为开发、构建新的高效基因治疗载体奠定实验基础。

癌基因激活是胃癌（GC）主要原因之一，而基因扩增则是细胞原癌基因激活成癌基因的重要途径。基因扩增的细胞遗传学标志是染色体上的均质染色区（HSRs）及染色体外的双微体（DMs），二者常出现于多种类型肿瘤细胞和耐药细胞中，与肿瘤发生发展及耐药密切相关。本课题应用aCGH、FISH和三代测序分析技术确定了胃癌NCI-N87细胞系4个扩增子及其扩增方式，采用qPCR及Westere blot方法从DNA、RNA和蛋白质水平确定了最高扩增倍数扩增子2内6个高扩增及高表达的相关基因（CDK12、STARD3、PERLD1、ERBB2、MIEN1和GRB7）；并经免疫组化验证515例临床胃癌样本中这6个基因蛋白产物的表达，揭示这6个共扩增基因的高表达与肠型胃癌显著相关, 其中STARD3、ERBB2和GRB7还与病理GⅡ级胃癌显著相关；此外，体外功能学实验进一步证明沉默PERLD1或ERBB2均可通过阻滞肿瘤细胞周期G1/S期以及诱导肿瘤细胞凋亡来削弱胃癌NCI-N87细胞增殖及侵袭的恶性表型，提示扩增子内高扩增高表达的基因PERLD1和ERBB2可能是胃癌相关的致癌基因。