耐氨甲蝶呤的人结肠癌细胞中双微体连接机制及进化研究

In this study, MTX-resistant HT29 colon cancer cells with gradually acquiring double minutes (DMs) will be used and DMs amplificated region will be acquired by Array CGH, next generation sequencing , SNP array and bioinformatics analyzing. Then breakpoints of the whole genome will be called by crest, BreakDancer and Delly based on the next generation sequencing data and then be compared with the results of Array CGH. We will use bioinformatics methods such as BEDTools to analyze the signatures of breakpoint junction sequences and demonstrate the formation mechanism of these breakpoints in DMs. Connect the recurrence of DMs breakpoints or SNPs in all MTX-resistant cell lines with their genome location to carry hierarchical clustering analysis. They will be used to confirm the evolution characters of both DMs and drug resistant tumor cells during drug resistance acquisition. This study will reveal the junction mechanism of double minute amplicons from the molecular level, demonstrate core targets in regulating formation of DMs, and discover evolution of DMs generation and evolution characteristics of drug resistant tumor under DMs driving. Our work will offer a new direction for inhibiting the formation of gene amplification, reversing tumor drug resistance and directing clinical tumor targeted and individualized therapies.

本课题拟采用氨甲蝶呤耐药过程中逐步形成双微体的HT29结肠癌细胞系为研究对象，以全基因组二代测序、Array CGH、SNP芯片检测并结合生物信息学分析，获得双微体相关的基因组扩增区域。应用crest、BreakDancer及Delly方法分析二代测序数据获得全基因组范围内断裂点，并与Array CGH芯片结果相验证。通过BEDTools等生物信息学方法分析断裂点处连接序列特征，阐明双微体上断裂点的形成机制。同时，通过研究不同浓度耐药细胞克隆中双微体区域断裂点和SNP的复现性，结合其基因组位置进行层次聚类分析，确定耐药过程中双微体的进化特征及肿瘤耐药克隆的进化特征。本研究将从分子水平揭示双微体上扩增子的连接机制，揭示调控双微体形成的关键靶点，明确双微体从无到有的进化过程及其驱动下肿瘤克隆的耐药进化特征，为抑制基因扩增的形成、逆转肿瘤耐药，进而实施临床肿瘤的靶向治疗及个体化治疗提供理论依据。

本研究旨在分子水平揭示双微体上扩增子的形成机制，并揭示肿瘤细胞获得耐药性的过程中双微体扩增子的进化方式及肿瘤耐药克隆的进化过程。本研究首先应用全基因组测序、SNP芯片及array CGH检测人结肠癌HT29 MTX耐药进化模型中的高扩增区域，利用FISH验证获得双微体相关的高扩增区域。应用CREST、LUMPY和DELLY构建断裂点筛选模型。分析array CGH数据，以CNV为依据对含有不同扩增形式的耐药细胞系进行5号染色体的断裂点筛选。比对两种不同平台所获得的断裂点合集，验证两组数据的一致性。选取CREST、LUMPY和DELLY筛选出来的双微体区域内的高置信断裂点，对其接头序列特性进行分析，获得双微体扩增子的形成机制。最后以所获得双微体扩增子断裂点在HT29 MTX耐药进化模型中的复现情况，对耐药细胞系进行层次聚类分析，得到双微体进化的特征及瘤内亚克隆的进化特点。本研究发现，联合应用CREST、LUMPY和DELLY共同调取全基因组测序SV断裂点，并设定具体阈值构建断裂点筛选模型的标准是严格且准确可靠的，同时此筛选模式更加适用于双微体区域高置信断裂点的筛选。在人结肠癌HT29 MTX耐药过程中，主要由非同源修复机制介导扩增子的形成，即NHEJ、MMRDR和MMEJ是双微体形成的主要分子机制，其关键因子可以作为去除肿瘤细胞中双微体的形成或逆转肿瘤耐药的关键靶点。双微体区域内的扩增子存在非线性的进化过程，部分双微体的扩增子由均质染色区脱落而来，但均质染色区并未完全降解。应用断裂点信息可以构建进化树，并界定染色体外基因组的有无，肿瘤耐药克隆进化过程趋近于三个阶段：未扩增耐药阶段、均质染色区扩增耐药阶段和双微体扩增耐药阶段。同时断裂点分析为研究肿瘤耐药进化提供了新的视角。