基于激光显微切割-质谱联用和RNA-seq技术的“公”“母”前胡质量差异形成机制研究

Peucedani radix is genuine medicinal material in Anhui province, which is known as “female Peucedani radix” before bolting and flowering stage , and called as “male Peucedani Radix ” while after the stage. The early bolting phenomenon affected output of “male ” Peucedani Radix and restricted the development of Peucedani radix industry. However, the formation mechanism of quality difference in “male” “female” Peucedani radix haven’t been revealed. This project proposes that, quality differences between “male” Peucedani radix and “female” Peucedani radix can be ascribed to different regular distribution of the content of coumarin in organization structure , which is moderated by bolting and flowering genes. On the basis of previous research, the project intend to carry out research on structures and development of male and female Peucedani radix; to determine the secondary metabolites of male and female Peucedani radix in different parts and different growth stages by laser microdissection and UPLC-QTOF-MS, to clarify the relation of organization structure and medicinal composition in “male” “female” Peucedani radix ; to compare differentially expressed genes of “male” “female” Peucedani radix using RNA-seq, to analyse the differential expression of bolting and flowering pathway-related genes, to identify and detect controlling genes activity in bolting and flowering pathway of Peucedanum declursivum Maxim, which systematically explains formation mechanism of quality differences in “male” “female” Peucedani radix.

前胡为安徽道地药材，抽薹开花之前采收习称“母前胡”（入药），开花后习称“公前胡”（不作药用）。栽培过程中的早薹现象导致“公”前胡产量激增，严重制约前胡产业发展，但“公”“母”前胡质量差异的形成机制尚未揭示。本项目提出：“公”前胡和“母”前胡的质量差异是香豆素类成分在组织结构中呈现不同分布规律所导致，其分子机制是由于抽薹开花途径基因活性或表达受到影响。本项目在前期研究基础上，拟开展“公”“母”前胡根的结构发育研究；联合LCM和UPLC-QTOF-MS技术对“公”“母”前胡不同部位中的香豆素类成分进行定性和定量研究，阐明“公”“母”前胡组织结构与成分的关系；通过RNA-seq技术分析“公”前胡和“母”前胡的转录组基因表达差异，筛选RPKM值具明显差异的抽薹开花途径基因，并通过qRT-PCR进一步验证；对筛选出的抽薹开花途径基因进行克隆及活性检测研究，系统阐明“公”“母”前胡质量差异的形成机制。

“雌雄”现象是前胡质量评价的重要特征之一，自古雌入药，雄者不入药。栽培过程中的早薹现象导致“雄”前胡产量激增，严重制约前胡产业发展，但关于“雌雄”的分子机制尚未揭示。本项目的工作假说：“雄”前胡和 “雌”前胡的质量差异是香豆素类成分在组织结构中呈现不同分布规律所导致，其分子机制是由于抽薹开花途径基因活性或表达受到影响。本项目针对上述假说，开展了如下的研究并得到相关结果：①通过查阅历代本草对前胡“雌雄”现象进行了本草学考证，结果表明前胡“雌雄”首次记载于清代《本草从新》，此后《药材资料汇编》等均记载雄前胡不宜药用。② 开展了“雄”前胡和“雌”前胡的根部显微结构及生长发育研究。研究发现“雌”前胡根肉质，根头顶部有细密的环纹，质地柔软，香味浓郁，次生木质部较小，皮层宽广，油管多而密集；而“雄”前胡根呈不规则圆柱形，表皮棕黑色，质硬而脆，气味寡淡，次生木质部占据主体，油管数量稀疏。③联合激光显微切割技术和UPLC-Q/TOF-MS对“雌前胡”和“雄前胡”的不同部位和不同组织进行了香豆素类等成分的比较分析，发现“雌前胡”周皮中检测到14个峰，次生韧皮部测得17个峰，形成层有5个峰，次生木质部含有9个峰；“雄前胡”的周皮中测得22个峰，次生韧皮部测得13个峰，形成层中共测得21个峰。④开展了“雄”前胡和“雌”前胡不同组织的转录组学分析，构建了“雄”前胡和“雌”前胡不同器官的转录组数据库，并对“雄”前胡和“雌”前胡不同器官中上调和下调的差异表达基因进行了富集分析；⑤开展了前胡开花基因CO、FLC和CAL的鉴定和表达分析，最终鉴定获得4个CO同源基因、2个FLC同源基因和5个CAL同源基因，并进行了全面的生物信息学分析和表达分析，筛选出了4个差异表达开花基因。⑥开展了4个差异表达开花基因的克隆和原核表达分析研究，结果表明含PpCO4、PpCAl2和PpCAl4基因重组蛋白的全菌及超声破碎后的上清液均出现明显目的蛋白条带。. 项目共发表论文3篇SCI。