基于冰冻制片-显微切割-液质联用的牛蒡子药材发育过程牛蒡苷积累规律研究

The active substance of Traditional Chinese Medicine is generally the secondary metabolism in plant development, and the accumulation regularity is an important aspect of the identification of the authenticity of Chinese Medicine. In this study, the dynamic changes of secondary metabolic components in the level of medicinal plants were studied by using the Frozen Matters - Microdissection - Liquid Chromatography Mass Spectrometry. The results showed that the cell structure of Arctium lappa sinensis was explored at the cellular level for the first time formation and distribution of major secondary metabolites in microstructure. The qualitative and quantitative analysis of lignans and other lignans were carried out on the different developmental stages and different cells (group) of Arctium lappa. To validate the hypothesis "effect of material composition of Fructus (lignans) is a germ cell (group) caused by the accumulation of dynamic secondary metabolism during development". Key scientific problems in solving the mechanism of accumulation of active ingredients in high quality authentic medicinal herbs. The method has the advantages of micro-pollution, fast and high sensitivity, and reveals the scientific problem of the dynamic accumulation of secondary metabolites in the level of medicinal plants. It is the advancement of the research on the chemical localization of plant tissue, rational use of traditional Chinese medicine resources, Chinese medicine identification, improve the quality of herbs and so has a broad application prospects.

中药的药效物质一般是植物发育过程中的次生代谢成分，其积累规律是中药真伪优劣鉴定研究的重要方面。本课题将冰冻制片-显微切割-液质联用等技术有机结合，研究药用植物在细胞水平次生代谢成分的动态积累规律，首次在细胞水平探索地道药材牛蒡子果实发育过程中细胞组织显微构造中主要次生代谢产物牛蒡苷的积累规律。对牛蒡子果实的不同发育期、不同细胞（群）进行牛蒡苷等木脂素类成分的定性定量分析研究。验证假说“牛蒡子药效物质成分（木脂素）是胚细胞（群）发育过程中次生代谢动态积累所致”。解决优质地道药材有效成分积累形成机制的关键科学问题。该方法具有微污染、快捷、高灵敏等优点，揭示药用植物细胞水平次生代谢产物的动态积累规律这一科学问题，是植物组织化学定位方法研究的推进，在中药材采收期的确定、合理利用中药资源、中药鉴定、提高药材质量等方面具有广阔的应用前景。

为探明牛蒡子（牛蒡的果实）生长发育过程中主要次生代谢成分牛蒡苷的动态积累规律，本研究使用HPLC法对牛蒡子不同部位种仁和果皮中牛蒡苷及苷元进行定量分析；使用UPLC-Q-TOF-MS法鉴定牛蒡子五个不同生长时期中主要次生代谢成分，鉴定出31个化合物，其中木脂素类21个。发现牛蒡子中种仁与果皮的牛蒡苷含量存在很大差异，牛蒡苷主要存在于牛蒡子种仁中。为进一步明确不同细胞中牛蒡苷的积累规律，激光显微切割技术与液质联用色谱分析技术相结合，精确收集不同生长时期的果皮石细胞和胚薄壁细胞，通过液质联用对不同生长时期的样品牛蒡苷等化学成分进行定量分析与比较。项目首次建立牛蒡子取材-冰冻制片-显微切割-液质联用分析的新方法，研究牛蒡子中主要化学成分牛蒡苷的动态积累规律。发现牛蒡苷在胚薄壁细胞花末期 (Ⅳ stage) 至成熟期 (Ⅴ stage) 大量积累，而在成熟期内果皮石细胞中，牛蒡苷也有一定积累，但远小于胚薄壁细胞中的牛蒡苷含量。这一结论对于牛蒡子采收期确定、栽培管理和牛蒡的植物保护具有重要意义, 充分体现了植物次生代谢产物的积累是植物化学防御的必然结果。牛蒡苷等次生代谢产物的大量积累，对牛蒡果实的抗病、抑菌、杀虫、自我保护等具有重要作用，在牛蒡种子萌发过程中，对种苗的发育也起到良好的保护作用。还证明了牛蒡子胚薄壁细胞和内果皮石细胞中的牛蒡苷的生物合成途径可能存在不同。为进一步研究牛蒡果实中主要次生代谢成分木脂素及木质素的生合成途径，对牛蒡植物进行基因组及转录组测序和分析，对生物合成途径中相关功能基因表达量进行差异化分析，初步总结了其可能的合成途径。目前对于牛蒡中牛蒡苷与牛蒡苷元生合成途径尚不明确，相关代谢基因有待进一步验证，某种未知的葡糖基转移酶将牛蒡苷元糖基化为牛蒡苷。这些数据为确定牛蒡苷合成途径提供参考，为牛蒡子石细胞的分子形成机制提供重要的研究方向。