噬菌体裂解酶细胞壁结合域抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成的机理与应用

Because of its multi-drug resistance, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) has become a global threat. Much worse, S. aureus could infect humans in the form of biofilm, which can lead to much stronger antimicrobial resistance. Therefore, it is important to find methods to inhibit its biofilm formation. In our previous research, we found that the cell wall binding domains (CBD) of bacteriophage lysins could be good ways to modify the cell wall surface of their host bacteria because of their high affinity to the cell walls and the huge number of binding sites (about 1E+07 per cell) on the walls. In view of the important roles of cell surface played in the process of biofilm formation, we will develop novel methods against S. aureus biofilm formation and elucidate the mechanisms behind by modifying S. aureus cell wall with different charged proteins and quorum sensing inhibiting molecular via CBDs of bacteriophage lysins. This research will generate new clues and targets for developing novel agents against S. aureus biofilm formation.

由于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）对多种常用抗菌药物耐药，MRSA已成为全球公共卫生体系的重大危害。更为严重的是金黄色葡萄球菌还能以生物膜形式感染，导致更强的耐药性。因此，研究控制金黄色葡萄球菌生物膜形成的机理和方法有着重要的理论和实际意义。我们的前期研究发现噬菌体裂解酶细胞壁结合域（Cell wall binding domain, CBD）能以较高的亲和力特异性结合靶细菌，且单个靶细菌表面存在大量的CBD结合位点（约10的7次方个），是一种用于细菌表面修饰和改性的工具。考虑到表面粘附在生物膜形成过程中起的重要作用，本研究拟以金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶CBD为修饰工具，将其与不同电荷的蛋白质、群体感应抑制分子融合表达，研究改变金黄色葡萄球菌表面电荷和群体感应信号对其生物膜形成的影响，探索抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成的新方法和途径，为金黄色葡萄球菌生物膜感染的控制提供新的解决思路。

金黄色葡萄球菌（S. aureus）是院内感染的重要病原菌之一，该菌除容易产生耐药性外，还会黏附在生物体或者植入物表面形成生物膜，导致更强的耐药性和抗逆性。噬菌体裂解酶是双链DNA噬菌体感染宿主晚期表达的一类肽聚糖水解酶，其C端的细胞壁结合域（CBD）能特异性的识别宿主菌细胞壁上细菌生存不可或缺的元件，而且，单个细菌表面存在数量巨大的结合位点。本项目旨在探讨通过噬菌体裂解酶细胞壁结合域修饰S. aureus后对其生物膜形成能力的影响及机制。以经典的SH3-like家族PlyV12裂解酶的CBD（V12CBD）为代表，研究了V12CBD抑制S. aureus生物膜形成的机理。研究结果表明V12CBD不仅能以时间、剂量和基因依赖的方式调控S. aureus生物膜的形成，而且影响S. aureus的基因表达和感染能力。（a）V12CBD对S. aureus生物膜形成的抑制效果呈现V12CBD剂量依赖效应。（b）V12CBD抑制S. aureus早期生物膜（< 4 h）的形成，而对生长时间超过4 h的生物膜的发展和成熟没有明显影响。（c）V12CBD降低生物膜中蛋白质和eDNA的分泌量。（d）V12CBD诱导S. aureus的聚集和生物膜的非正常堆积，导致生物膜的异质化和不均匀分布，并且不能形成经典的胶粘网状结构。（e）V12CBD对S. aureus生物膜的抑制作用受srtA基因的影响，对srtA缺失的S. aureus RN4220的生物膜形成没有影响。（f）转录组分析表明V12CBD影响S. aureus 225个基因差异表达，其中表达上调基因111个，表达下调基因114个。多种毒力基因表达下调，包括与黏附相关的基因sdrC，与荚膜多糖合成相关的基因tarI，与寡肽摄取相关基因oppF2，与摄取胞外L-脯氨酸相关基因PutP，以及维持感染相关的基因mcsB等。（g）V12CBD降低S. aureus的入侵和感染能力。V12CBD结合之后的S. aureus对上皮细胞A549的粘附和入侵能力明显降低，而且更易被巨噬细胞RAW264.7杀灭和清除。相同细菌浓度下V12CBD结合之后的S. aureus攻毒组小鼠具有更高的存活率。综上，本项目研究结果表明V12CBD能抑制S. aureus生物膜的形成，降低其入侵能力和感染毒力，具有预防和治疗S. aureus感染的潜力。