弥散性神经内分泌细胞标志物与山羊黄体细胞凋亡的关系

黄体在哺乳动物生殖周期中起着"关卡"作用，它的正常退化是启动下一个生殖周期的前提，而黄体细胞凋亡则是黄体退化的主要因素。本项目组的前期研究表明，山羊和牛黄体中存在一定数量的弥散性神经内分泌细胞，且弥散性神经内分泌细胞标志物- - 神经特异性烯醇化酶、突触素、5-羟色胺和S-100蛋白随着黄体的发生而出现、随着黄体的退化而消失，综合分析推断，这些标志物在黄体细胞的凋亡中必然发挥一定作用。为此，本项目拟以这些最新的研究结果为基础，应用免疫组织化学SP法、原位杂交法、DNA末端原位标记法、RT-PCR、放射免疫测定法和细胞培养法等多种方法，综合研究上述四种标志物对山羊在体黄体细胞和离体培养的黄体细胞中凋亡调控基因、凋亡执行基因和相关激素表达的影响，探明这四种标志物与黄体细胞凋亡之间的关系。其结果将对揭示黄体退化和妊娠维持等机理提供新的理论依据，并对探索这四种标志物新的生理功能及其应用具有重要意义。

本项目的前期研究表明，在山羊和牛黄体中存在神经特异性烯醇化酶（NSE）、突触素（SYP）、5-羟色胺（5-HT）和S-100蛋白等弥散性神经内分泌细胞标志物，而这些标志物在黄体细胞中作用尚不清楚。因此，本项目采用免疫组织化学SP法、原位杂交法、DNA末端原位标记法、RT-PCR、Western Blot法、细胞培养法和黄体细胞转染pCI-neo-hTERT等等多种方法，对这些标志物在黄体中的分布及与黄体细胞凋亡的关系进行了一定探讨。获得如下重要结果：①四种标志物之中的随机组合的三种物质在黄体组织中共存于同一黄体细胞的现象具有普遍性,不同的三标记组合之间的相关系数均大于0.7，表明四种物质很有可能共存于同一个黄体细胞中。②在妊娠期山羊黄体中，四种凋亡蛋白（Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2和Bax）相对表达量总体趋势相似，即呈现出妊娠前期较低，妊娠后期升高，中期的变化差异各不相同；相关性分析表明：Caspase-3与Caspase-9显著相关；Bax与黄体凋亡呈正相关，与Caspase-3和Bcl-2呈负相关，与Caspase-9没有相关性。③5-HT在10-7-10-4mol/L浓度范围内，不能通过调节bax/bcl-2的比值的方式影响黄体细胞的凋亡；5-HT在10-4-10-8mol/L 浓度范围内，对山羊黄体细胞有促增殖作用，且随着5-HT浓度的升高而增强。④催产素（OT）可促进SYP及SYP mRNA的表达，并呈一定的剂量依赖性；高浓度OT可明显降低黄体细胞细胞活力及孕酮分泌，且细胞的存活和生长与培养液中孕酮的含量相关。⑤NSE对体外培养的黄体细胞的有促进生长作用。⑥克隆了山羊NSE基因CDS区，生物信息学分析表明，NSE在山羊、牛、大鼠、小鼠和人中保守性很高。⑦建立了较完善的山羊黄体细胞鉴定方法：在mRNA水平上，3β-HSD和17β-HSD7可作为鉴定黄体细胞的方法。在蛋白水平上，SYP结合OT的表达可以作为黄体细胞的鉴定方法。⑧初步建立永生化山羊黄体细胞系。上述研究结果将为深入揭示黄体退化机理和探索神经内分泌标志物新的生理功能及其应用奠定了重要基础。