视黄酸诱导神经干细胞分化过程中蛋白磷酸化的动态研究

The regulation of neural stem cells (NSCs) differentiation is an important question in the basic research and clinical application of NSCs.Retinoic acid (RA) is a critical signaling molecule, which is involved in neural differentiation and neurogenesis. However, the molecular mechanism underlying RA-induced neural stem cell diferentiation remains unclear. In this study, we utilized the SILAC (Stable isotole labelling by amino acids in cell culture) quantitative phosphoproteomics technique to analyze the protein phosphorylation dynamics of RA-induced rat NSCs differentiation. In combination of various biogical techniques including biochmistry, molecular biology, cell biology and bioinformatics, we will examine the function and regulary mechanism of critical phosphorylated proteins in RA-induced NSCs differentiation.Furthermore, we will investigate the impacts and specific pathways of critical phosphoproteins on the regulation of RAR-RXR receptors, their related transcriptional coactivators and corepressors, and the downstream neural stem cell markers and neuron markers,such as SOX1 and MAP2.Our studies would provide many important clues in the investigation of the molecular mechanism of NSCs differentiation and the neurodegenerative therapy.

神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)的分化调控机制是神经干细胞基础与临床应用研究中的关键问题。视黄酸（Retinoic acid, RA）是参与神经分化和神经形成的重要神经发育信号分子，可诱导NSCs向神经元分化，但其调控NSCs 分化过程中的蛋白磷酸化动态研究尚未见报道。本研究以RA诱导NSCs分化为模型，主要利用细胞培养稳定同位素标记SILAC技术为主的定量蛋白质组学技术进行蛋白磷酸化修饰的动态分析，结合生化/分子/细胞生物学及生物信息学等生物学手段，对RA诱导NSCs分化过程中的关键磷酸化蛋白进行深入功能分析，研究筛选的关键磷酸化蛋白在NSCs分化中调控RA信号中的RAR-RXR受体与其相关转录共激活与共抑制复合物，进而调节下游SOX1和MAP2等神经干细胞标志基因和神经元标志基因的途径。本研究对于探索NSCs分化机制和神经退行性疾病的治疗具有重要意义。

随着我国人口老年化日趋严重，以神经元的变性死亡为主要特征的神经退行性疾病发病逐渐升高。神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)的分化调控机制是神经干细胞基础与临床应用中的关键问题。本研究首先建立先进的蛋白质组学新技术方法，然后以视黄酸（Retinoic acid, RA）诱导NSCs定向分化神经元为模型，利用SILAC 定量蛋白质组学技术分析NSCs分化过程中蛋白磷酸化修饰的动态分析。最后研究了神经细胞损伤死亡的分子机制。项目执行期间发表SCI收录研究论文8篇，主要的研究成果如下：.1. 蛋白质组学新技术新方法方面的进展成果.本项目建立CATSET多磷酸化肽分步富集方法，实现了多磷酸化肽和单磷酸化肽的分步富集分析，提高多磷酸化多肽的鉴定效率3倍以上，总的磷酸化多肽鉴定效率可提高20%以上。多肽N-末端TMPP-Ac-OSu正电荷衍生建立De Novo从头测序技术方法以及基于TMPP的稳定同位素标记蛋白质定量方法实现了蛋白质高可信度鉴定和定量，鉴定蛋白质序列覆盖率达到80%以上。.2. 神经干细胞诱导分化的磷酸化蛋白质组学研究方面的进展成果.项目首次构建了大鼠胚胎NSCs磷酸化蛋白质组数据库。项目通过SILAC定量蛋白质组学技术分析了RA诱导分化0.5小时和48的神经干细胞中蛋白质磷酸化修饰的变化，定量NSCs分化过程中的14263个高可信度的磷酸化修饰位点。我们鉴定到Wnt信号通路在分化过程中发生变化的69个磷酸化位点，进一步研究表明Wnt/beta-catenin在神经发育和NSCs的增殖分化中具有重要作用。.3. 神经细胞损伤死亡机制方面的进展成果.神经元的损伤死亡是神经退行性疾病的重要特征。课题组研究发现：1）首次揭示了PGC-1α/ERRα-Sirt3信号通路介导的SOD2-K130和ATP synthase β-K485去乙酰化作用对神经元的保护作用机制。2）首次发现抗氧化蛋白PRDX6对线粒体自噬的调控机制。3）首次揭示了miR-137-EZH2-CLU/NGFR信号通路在白藜芦醇诱导神经母瘤细胞凋亡中的调控机制。.总的说来，项目研究成果为蛋白质组学研究提供了有用的工具方法，为深入了解NSCs分化的磷酸化调控机制和神经元死亡的作用机制提供了重要的信息。