产油酵母应答磷限制的机制及其应用研究

微生物过量积累油脂是有重要应用价值的生命现象。通常在氮限制条件下产油微生物高效积累油脂；然而，许多天然/廉价原料氮含量高，应用氮限制策略难以取得理想结果。我们发现，产油酵母在磷限制下也可高效积累油脂，为转化富氮原料提供了新技术，但对其生物学基础缺乏了解。本项目拟以圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides为模式菌株，通过分析不同碳/磷比营养条件下的基因表达、蛋白质和关键代谢物的差异，结合生物信息学分析，提出磷限制导致油脂积累的生物学模型；通过生物化学和分子生物学实验，深入解析相关基因的功能，完善相应分子机制；探索进一步开展菌株理性改造研究，获取具有新性状的工程菌株。本项目将阐明产油酵母应答磷限制并导致油脂积累的机制，丰富磷调控微生物代谢的基础理论，获得大量关于磷和油脂代谢及调控的新信息和新材料。项目成果将为微生物代谢调控和合成生物学研究及高效利用生物质资源提供科学指导。

微生物过量积累油脂是有重要应用价值的生命现象。通常在氮限制条件下产油微生物高效积累油脂；然而，许多天然/廉价原料氮含量高，应用氮限制策略难以取得理想结果。前期研究发现，产油酵母在磷限制下也可高效积累油脂，为转化富氮原料提供了新技术，但对其生物学基础缺乏了解。本项目计划圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides为模式菌株，通过分析不同碳/磷比营养条件下的基因表达、蛋白质和关键代谢物的差异，结合生物信息学分析，提出磷限制导致油脂积累的生物学模型；通过生物化学和分子生物学实验，深入解析相关基因的功能，完善相应分子机制；探索进一步开展菌株理性改造研究，获取具有新性状的工程菌株。. 项目执行期间，完成了不同磷营养水平下圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides的差异转录组、差异蛋白质组和代谢组学分析，结合生物信息学方法分析了上下调基因的功能。结果表明，磷限制显著影响磷代谢相关基因，其中核糖核酸酶Rny1、磷酸化酶Pho8和Phm8显著上调，使液泡内RNA降解成核苷单磷酸NMP，其中腺苷单磷酸AMP磷酸基团被去掉生成腺苷，造成AMP含量下降，从而降低了受AMP别构调节的异柠檬酸脱氢酶Idh的活性，促使细胞利用柠檬酸为前体合成并积累油脂；磷脂酸(Phosphatidic acid, PA)作为甘油二酯(diacylglycerol, DAG)和磷脂(phospholipid, PL)合成的共同底物，在磷限制条件下，PA磷酸水解酶Pah1显著上调、DAG激酶Dgk1显著下调，促使PA大量水解生成DAG，进而提高甘油三酯（triacylglycerol, TAG）的合成；通过荧光定量PCR验证了组学差异基因的上下调情况，实验结果与组学数据基本一致；在油脂合成能量供给方面，磷限制使NADPH含量显著下降，可能会限制油脂积累，因此，构建了过表达苹果酸酶ME的工程菌株，发现在相同培养条件下工程菌株的油脂含量是野生型的2倍，结果验证了ME的功能。. 本项目已全面完成了研究计划中的内容，获得了预期研究结果。通过本项目的研究，获得了一批新的生物学材料和信息，揭示了磷限制导致油脂积累独特的分子机制，丰富磷调控微生物代谢的基础理论，为理性改造产油酵母、合理设计发酵培养模式、以及深入了解微生物过量积累油脂的生物学现象奠定了科学基础。