烟酰胺嘧啶二核苷酸生物合成与应用的基础研究

Pyridine nucleotide cofactors link major redox metabolic reactions, as well as many non-redox biochemical transformations. Therefore, it is intrinsically difficult to control one particular reaction precisely at the cofactor level. We have synthesized a number of pyridine nucleotide cofactor analogs, devised redox enzymes matching those analogs, and advocated a non-natural cofactor-based chemical biology. In this project, we plan to engineer the ATP binding site of nicotinamide mononucleotide (NMN) adenylyltransferase to accept pyrimidine triphosphate instead of ATP for direct biosynthesis of nicotinamide pyrimidine dinucleotides (NPyD) from NMN and pyrimidine triphosphate. We will then use the gene encoding the synthase for typical NPyD molecule nicotinamide cytosine dinucleotide (NCD) to engineer NCD self-sufficient strains. Phosphite-sensitive hosts will be engineered to overexpress NCD synthase and NCD-specific phosphite dehydrogenase for high-throughput screening genes encoding novel NCD-preferred oxidoreductase. Next, we will introduce these genetic elements into microbial hosts to set up various NCD-linked metabolic sub-systems, and analyze the mechanisms how these sub-systems work and interact with the global metabolic network. The results of this project should provide new biological materials, tools and strategies for the chemical biology and synthetic biology community to engineer advanced microbial strains for diverse applications and to address challenging problems related to pyridine nucleotide cofactors.

吡啶核苷酸辅酶是介导氧化还原代谢的重要辅酶，并广泛参与其它生物学过程；因此，改变吡啶核苷酸水平的生物学效应靶向性低，难以预测。申请人前期合成了多种吡啶核苷酸类似物，改造并获得了适配的氧化还原酶，初步形成了基于非天然辅酶的代谢调控研究思路。本项目拟改造烟酰胺单核苷酸（NMN）腺苷转移酶，赋予其腺苷三磷酸结合域识别嘧啶苷三磷酸的功能，获得烟酰胺嘧啶二核苷酸（NPyD）合酶，并建立相关生物合成方法。以NPyD的代表烟酰胺胞嘧啶二核苷酸（NCD）为例，研究利用NCD合酶、NCD专一性亚磷酸脱氢酶和亚磷酸敏感性宿主，构建高通量筛选平台，获得新的NCD偏好型氧化还原酶，丰富NCD关联的生物元件和作用模式。利用上述材料，设计构建具有NCD自给表型的工程菌，研究NCD介导代谢子系统的运行规律及其与全局代谢网络的相互作用。为化学生物学、合成生物学研究和先进细胞工厂设计提供新材料、新工具和新思路。

吡啶核苷酸辅酶是介导氧化还原代谢的重要辅酶，并广泛参与其它生物学过程；因此，改变吡啶核苷酸水平的生物学效应靶向性低，难以预测。申请人前期合成了多种吡啶核苷酸类似物，改造并获得了适配的氧化还原酶，初步形成了基于非天然辅酶的化学生物学研究思路。.为实现烟酰胺嘧啶二核苷酸（NPyD）生物合成，本项目以大肠杆菌烟酸单核苷酸（NaMN）腺苷酰转移酶（NadD）为模板，采用半理性设计策略，分别改造其底物结合口袋，筛选获得了偏好烟酰胺单核苷酸（NMN）和嘧啶苷三磷酸的突变体，即NPyD合酶，并重点表征了偏好NMN和胞嘧啶三磷酸（CTP）的突变体，即烟酰胺胞嘧啶二核苷酸（NCD）合酶（NcdS），建立了NCD生物合成及大量制备的方法。解析了两种NcdS蛋白的晶体结构，揭示了底物偏好性从ATP和NaMN分别转变为CTP和NMN的结构基础；解析了两种NCD偏好型亚磷酸脱氢酶（Pdh*）及其与NCD复合物的晶体结构，揭示了偏好NCD的结构基础；利用NcdS、NMN合成酶和CTP合成酶等元件，构建了多种组合表达载体及NCD合成模块，获得系列NCD自给型大肠杆菌工程菌，胞内NCD浓度最高可达5.0 mM；利用NcdS、Pdh*和亚磷酸盐敏感性大肠杆菌BW14329，构建了高通量筛选NCD-依赖型氧化还原酶突变体文库的平台。以大肠杆菌BW25113(△ldhA, dld::cat)为宿主，通过整合表达NCD合成模块和过表达NCD偏好型亚苹果酸酶（Mae*）及D-乳酸脱氢酶（DLDH*），所得工程菌利用L-苹果酸合成D-乳酸的转化率为53.8%，比不含NCD合成模块的对照菌株高4倍，建立了NCD介导的氧化还原代谢调控体系。利用NCD合成模块、Pdh*、Mae*、DLDH*和NCD偏好型甲酸脱氢酶等元件，构建了系列基于NCD的大肠杆菌细胞工厂，相关多组学研究尚在进行中。以上部分研究成果已在《自然-通讯》、《德国应用化学》等重要学术刊物发表。.总之，本研究解决了胞内NCD供给难题，提供了大量制备NCD的方法，获得了一批NCD关联的新生物学元件和工程菌株，为基于非天然辅酶的合成生物学和化学生物学研究奠定了基础，具有重要科学意义和应用潜力。