自噬降解通路对产油酵母油脂积累的影响及其分子机制

Lipid-producing yeasts remodel the cells and accumulate substantial lipids in response to nutrient stress, such as nitrogen or phosphorus limitation, but the detailed molecular mechanism is unclear yet. Autophagy is a highly conserved cellular process which execute catabolic degradation of cellular components for cell reconstruction to adapt the environment stress in eukaryotes. In our previous study, we identified at least 24 autophagy associated genes in the oleaginous fungus Rhodosporidium toruloides. During lipid accumulation, we also found up-regulated expression levels of some genes coding autophagy related proteins, including vacuolar lipases, proteases, amino acid permeases and others, which suggested the involvement of autophagy in the regulation of lipid overproduction. Hereby, we propose to use the R. toruloides as the model system, via techniques such as GFP-ATG8 indirectly labeling of autophagosome, autophagic flux analysis, autophagy related gene knock-out & complement and Real-time PCR, and treat with autophagy activator or inhibitor, β-oxidation inhibitor to (1) identify the components of autophagic machinery and their associated functions in R. toruloides, (2) elucidate the contribution of amino acid recycling to lipid accumulation, (3) find out the roles of β-oxidation of fatty acids recycled from autophagic degradation of membrane in lipid overproduction. The anticipated results will advance our understanding on the molecular mechanism of the autophagy regulation in lipid accumulation, and the deepen our recognizing on the connection between autophagy and microbial growth & metabolism. The proposed study will also provides biological information and parts for rational engineering of lipid-producing yeast, and synthetic biology to produce fatty acid derived biofuels and biochemicals.

产油酵母响应营养胁迫信号经胞质重构进行油脂积累的分子机制尚不清楚。细胞自噬是真核细胞高度保守的应激调控机制，是亚细胞降解和胞质重构最主要方式。前期研究发现，圆红冬孢酵母基因组编码至少24个ATG蛋白，油脂积累过程中自噬相关的液泡脂肪酶和氨基酸透性酶等表达上调，暗示自噬参与了油脂积累调控。本项目拟以圆红冬孢酵母为对象，利用GFP-ATG8间接自噬体标记技术、自噬潮分析、基因敲除-基因回补分析等方法，结合自噬抑制剂、激活剂和β-氧化抑制剂处理，进行以下研究：1）圆红冬孢酵母自噬降解通路的分子组成和功能；2）氨基酸循环利用对油脂积累的贡献度；3）细胞膜经自噬生成的脂肪酸，经线粒体β-氧化途径对油脂积累的影响；从而深入解析自噬调控产油酵母油脂积累的分子机制。本研究将丰富细胞自噬调控微生物生长和代谢的基础理论，并将获得大量新生物信息和材料，对理性设计产油酵母新性状，开展油脂合成生物学研究具有重要意义

细胞自噬是真核细胞高度保守的应激调控机制，是亚细胞降解和胞质重构最主要方式。前期研究发现，圆红冬孢酵母油脂积累过程中自噬相关的液泡脂肪酶和氨基酸透性酶等表达上调，暗示自噬参与了油脂积累调控。本项目拟以圆红冬孢酵母为对象，利用间接自噬体标记技术、基因敲除-基因回补分析等方法，结合自噬抑制剂、激活剂和β-氧化抑制剂处理，进行以下研究：1）圆红冬孢酵母自噬降解通路的分子组成和功能；2）氨基酸循环利用对油脂积累的影响；3）线粒体β-氧化途径对油脂积累的影响；从而深入解析自噬调控产油酵母油脂积累的分子机制。. 项目执行期间完成了以下研究：1）基于生物信息学分析，确定了 R. toruloides 自噬降解通路组成。2）通过酿酒酵母功能互补分析，确认了RtATG8、RtATG9可以互补相应的酿酒酵母基因敲除菌株ATG8、ATG9基因功能的缺陷。3）通过RtATG8、RtATG9组成型基因敲减菌株的构建，证明自噬功能缺陷影响油脂积累，限氮和限磷培养时其胞内油脂含量较野生型圆红冬孢酵母下降了50%。4）FAS1和FAS2基因敲减导致油脂合成减少，自噬也受到抑制。5）利用自噬激活剂（雷帕霉素）、自噬抑制剂（3-甲基腺嘌呤, 3-MA）和β-氧化抑制剂（2-溴辛酸，2-BA），研究了自噬降解通路和线粒体 β-氧化途径的相互作用以及对油脂积累的影响，发现自噬激活剂（雷帕霉素）使用时圆红冬孢酵母油脂含量无大的变化；而自噬抑制剂（3-甲基腺嘌呤, 3-MA）和β-氧化抑制剂（2-溴辛酸，2-BA）使用时，限氮培养和限磷培养条件下菌株胞内油脂含量有30%以上的增加。6）产油酵母脂滴蛋白质组及其中自噬相关蛋白发现。7）构建 RtATG22、 RtAVT4 和 RtAVT1 基因灭活菌株，基因回补和相应氨基酸回补的实验尚在进行中。. 本项目已全面完成了研究计划中的内容，获得了预期研究结果。通过本项目的研究，获得了一批新的生物学材料和信息，揭示了自噬对油脂积累的影响和分子机制，为理性改造产油酵母、合理设计发酵培养模式、以及深入了解微生物过量积累油脂的生物学现象奠定了科学基础。.