人工辅酶NCD介导选择性扰动氧化还原代谢的基础研究

To control metabolism is crucial in terms of developing effective drugs and microbial cell factories. Because the cofactor nicotinamide adenosine dinucleotide (NAD) mediates major redox reactions and other non-redox biological events, many studies have been focused on manipulating cellular cofactor level to control metabolism. However, an intrinsic problem is that it can not have the targeted reaction receiving the effect of cofactor fluctuation exclusively. To address this problem, we prepared artificial cofactors including nicotinamide cytosine dinucleotide (NCD), constructed NCD-dependent mutants of malic enzyme and lactate dehydrogenase, and created bioorthogonal redox systems. In this proposal, we will construct NCD-dependent mutants of phosphite dehydrogenase and NADH oxidase in order to establish artificial cofactor regeneration systems. We will then assemble coupled enzymatic systems to mimic intracellular complexity, and evaluate the performance of these systems in the presence of phosphite/O2 as terminal electron donor/acceptor. Next we will engineer Escherichia coli to express genes encoding enzymes for artificial cofactor transporting, utilization and regeneration, to obtain strains carrying different artificial redox metabolism. Finally, we will investigate the biological consequences of NCD-mediated perturbation of the pyruvate node in the presence of extracellular electron donor/acceptor. Together, this proposal will establish a unique method to perturb cellular redox chemistry. It will generate new tools and materials for chemical biology and synthetic biology to enable more precise controlling of metabolism, which in turn, is key to advanced biotechnology.

调控代谢过程对治疗疾病和构建高效细胞工厂至关重要。因烟酰胺腺嘌呤二核苷酸等辅酶广泛参与代谢反应及其他生物过程，扰动辅酶水平已成为代谢调控的常用手段，但存在缺乏反应选择性的固有缺陷。我们曾合成了人工辅酶烟酰胺胞嘧啶二核苷酸（NCD），获得了偏好NCD的苹果酸酶和乳酸脱氢酶突变体，构建了生物正交的氧化还原体系。本项目拟改造亚磷酸脱氢酶和还原型辅酶氧化酶，获得偏好NCD的突变体，建立人工辅酶再生方法；构建拟胞内环境的多酶耦合体系，以亚磷酸/氧气为终端电子供/受体，研究反应的效率和选择性；以大肠杆菌为宿主，组合表达编码人工辅酶转运、利用和再生相关酶的功能基因，建立靶向性扰动氧化还原反应的研究平台；揭示NCD介导，外源电子供/受体影响工程菌丙酮酸节点代谢反应的规律。本项目将建立一种选择性扰动氧化还原代谢的新方法，为理性调控代谢过程提供化学生物学新工具，为代谢途径设计和合成生物学研究提供新材料。

调控代谢过程对构建高效细胞工厂至关重要。因烟酰胺腺嘌呤二核苷酸等辅酶广泛参与代谢反应及其他生物过程，扰动辅酶水平已成为代谢调控的常用手段，但存在缺乏反应选择性的固有缺陷。我们曾合成了非天然辅酶烟酰胺胞嘧啶二核苷酸（NCD），获得了偏好NCD的苹果酸酶突变体（ME*），构建了生物正交的氧化还原体系。本项目开展了NCD转运、氧化还原酶的辅酶偏好性改造、体外多酶耦合体系构建、非天然辅酶利用和再生酶共表达体系构建和选择性扰动氧化还原代谢等五方面研究。建立了基于核苷酸转运蛋白表达使宿主细胞有效摄取NCD的方法。基于结构信息采用半理性设计方法，构建亚磷酸脱氢酶（PDH）和D-乳酸脱氢酶（LDH）突变体表达文库，以NCD为辅酶筛选得到高活性阳性克隆，其中PDH突变体（PDH*）和LDH突变体（LDH*）的NCD偏好性分别提高5700倍和800倍。利用野生型酶及PDH*、ME*、LDH*和NCD偏好性甲酸脱氢酶（FDH*）等，构建了体外多酶耦合催化体系并研究其催化特性，揭示了NCD偏好型催化元件的适配性、NAD介导体系与NCD介导体系的正交性、以及还原力传递选择性和效率等重要科学问题。以编码核苷酸转运蛋白、野生型氧化还原酶及PDH*、FDH*、ME*和LDH*等功能基因元件，构建出系列E. coli工程菌株，研究了其催化行为，发现亚磷酸/NCD体系可选择性驱动苹果酸合成，苹果酸产量和得率比不添加NCD的体系均提高约36%，而甲酸/NCD体系可利用甲酸作为能源和碳源选择性驱动丙酮酸还原羧化。成功实现利用外源化学物质为终端还原剂/电子供体，选择性扰动胞内物质代谢途径。本项目积累了多种非天然辅酶NCD-依赖型生物学元件和菌株材料，为合成生物学和化学生物学研究提供了独特工具，对精确设计“细胞工厂”和代谢途径选择性传递能量具有重要意义。研究成果在Angew. Chem.和ACS Catal.等学术刊物上发表论文5篇，获授权发明专利1件，申请发明专利5件，毕业博士研究生3人，出站博士后1人。