极地海冰细菌金属蛋白酶PPC结构域与底物蛋白相互作用的分子机制研究

极地海冰是世界上最冷的生存环境之一，变化极大的光照辐射、贫乏的营养供给、终年的低温造就了微生物特殊的生理生化特征。假交替单胞菌SM495是一株分离自北极海冰的适冷菌，该菌分泌胞外金属蛋白酶E495。其成熟酶除催化结构域这种形式以外，还同时存在C端带一个PPC结构域，带两个PPC结构域另外两种形式。本项目以该酶作为主要的研究对象，比较三种不同成熟形式的E495催化特性及底物特异性，并与同家族的其它不同来源的蛋白酶进行比较研究，阐明E495对生态环境适应的相关机制。然后根据已获得的E495的基因序列对2个PPC结构域进行克隆和重组表达，采用pull-down、SPR和ITC等方法研究PPC与蛋白底物之间的相互作用。并通过定点突变、同源模建、分子模拟等方法分析PPC与底物蛋白相互作用的分子机理，揭示PPC结构域存在的生态学功能。这些研究将为揭示海冰中蛋白质的分解代谢与氮循环机制提供理论依据。

海冰是极地海洋的一个重要部分，对极地海洋的生产力有十分重要的影响。Pseudoalteromonas sp. SM495是从北极海冰中分离得到的一株典型的适冷菌，E495是其胞外分泌量的最丰富的蛋白酶，该蛋白酶属于嗜热菌素家族。我们首次发现E495的PPC结构域（Pre-peptide C-terminal domain）在分泌到胞外的过程中没有被切除，即不含PPC结构域（E495-M, 34 kDa，催化结构域）、带有1个PPC结构域（E495-M-C1，45 kDa），和带两个PPC结构域（E495-M-C1-C2，60 kDa）三种活性形式同时存在。我们首先分离纯化，得到纯的E495-M和E495-M-C1，然后对E495-M和E495-M-C1进行了一系列性质研究。研究表明E495-M 与同家族不同来源的Pseudolysin、MCP-02的底物特异性不同，E495-M够高效的催化藻类蛋白水解。进一步比较E495-M和E495-M-C1发现，二者对寡肽底物有类似的催化效率和底物亲和力，而 E495-M-C1对别藻蓝蛋白（APC），藻蓝蛋白（CPC）和酪蛋白（α-casein）有着更高的催化效率和底物亲和力，表明PPC结构域在催化蛋白底物降解中有一定的功能。将PPC结构域与谷胱甘肽标签蛋白融合表达，检测PPC结构域的功能。“pull-down”亲和层析和等离子共振（Surface Plasmon Resonance）实验表明，PPC结构域能够吸附较大的底物蛋白分子如藻蓝蛋白或酪蛋白。证明E495-M-C1中的PPC1结构域可以帮助酶蛋白结合蛋白底物，从而提高该酶的催化效率。本项目还通过生物信息学分析和定点突变实验证明，PPC结构域中的D26, D28, Y30, W65是影响蛋白底物结合的关键位点。酪氨酸（Y）和色氨酸（W）都含有一个巨大的疏水的芳香环，说明疏水相互作用在维系PPC结构域与底物蛋白相互作用中扮演着重要的角色。而26位和28位天冬氨酸（D）可能通过形成盐桥来增强PPC结构域与底物的结合。这些研究结果表明E495的三种不同成熟形式可能是Pseudoalteromonas sp. SM495高效降解海冰中有机物质的一种生态适应，本项目的研究为揭示海冰环境中可溶蛋白的降解机制以及阐明海冰氮循环的机理奠定基础。