细菌胞外蛋白酶C末端PPC结构域吸附功能的多样性及其分子机制

PPC domain is widely present in the C terminus of bacterial extracellular protease. However, its function has not been fully elucidated. In this project, our aim is to determine the affinity function diversity of PPC domain and its molecular mechanism. First, we will determine the sequence divesity of PPC domains by analyzing the sequences and structures of PPC domains with bioinformatics methods. Second, we will determine the affinity function diversity and significant differences of PPC domains of M4 metalloproteases from various bacteria species. These studies include enzymatic properties，substrate speicificity of different metalloproteases and binding functions of PPC domains to different protein substrates. Third, we will determine key residues and mode of interaction that cause the difference in the binding function of PPC domains by mutagenesis, molecular dynamic simulation and observation of ultramicrostructure, therefore elucidate the molecular mechanism of affinity function diversity of PPC domains,and developing the new use of PPC domain. Finally, we will generate chimeric proteases with novel structure and characterize the function. A gene-swapping technique will be performed, which swaps different functional PPC domains from one protease to another. Results from these studies will provide critical understanding on molecular mechanism of affinity function diversity and ecological significance of PPC domain.

PPC结构域广泛存在于分泌型细菌胞外蛋白酶的C端，目前为止其功能还未明确，缺乏系统研究。本项目以PPC结构域为研究对象，重点研究来源于不同环境细菌的PPC结构域吸附功能的多样性及其分子机制。首先，通过生物信息学手段对PPC结构域的序列进行系统分析，解析PPC结构域序列结构的多样性及其规律。然后，比较不同细菌分泌的具有PPC结构域的同家族蛋白酶的酶学特性、底物特异性及其PPC结构域吸附功能的差异，揭示不同环境来源的PPC结构域吸附功能的多样性及其存在于蛋白酶C端的生态学意义。进而通过基因突变、超微结构观察和动力学模拟，分析造成PPC结构域吸附功能差异的关键位点和作用机理，从而阐明PPC结构域吸附功能多样性的分子机制，并为开发PPC结构域在底物改性中的新用途奠定基础。最后,对不同吸附功能的PPC结构域间进行基因置换，比较重组酶与野生酶的活性变化，为构建新结构、新功能的蛋白酶提供理论依依据。

PPC 结构域广泛存在于分泌型细菌胞外蛋白酶的 C 端，目前为止其功能还未明确，缺乏系统研究。本项目以 PPC 结构域为研究对象，重点研究不同环境细菌来源的 PPC 结构域吸附功能的多样性及其分子机制。首先通过信息学方法，对不同种属细菌来源的PPC结构域进行进化分析，发现有些细菌PPC结构域可能来源于自身基因重复，有些则可能来源于基因水平转移，并推测了PPC结构域的进化路径及可能的进化方式。其次，利用自行建立的底物反浸酶谱法，从实验室保存的细菌中鉴定了8种含有PPC结构域的蛋白酶。结合动力学分析、紫外诱变等手段对它们的酶学性质进行研究，分析了含有PPC结构域的蛋白酶对胶原蛋白的降解能力及膨胀作用。然后，异源表达了来源于不同菌蛋白酶的10个PPC结构域，利用新建立的ANS检测方法和“Pull-down”实验，对PPC结构域与底物蛋白的吸附能力和膨胀活性进行了比较，发现不同的PPC结构域在底物吸附能力上虽然有所差异，但都对蛋白类生物大分子有一定的吸附能力。进一步根据PPC结构域序列比对结果，筛选出结构域中保守的氨基酸位点（Y6, S12, D26, D28, Y30, W42, E53, C55, Y65）。并以胶原蛋白吸附膨胀能力较强的empA-PPC作为模板，构建一系列氨基酸点突变体，发现突变体D26N, S12I/D26N, D28N, W42A 和E53Q对底物的吸附能力完全丧失，突变体S12I/D26N膨胀能力基本丧失，推测PPC结构域吸附能力与蛋白表面芳香族氨基酸密切相关。最后，通过电镜和光谱检测了PPC结构域对胶原蛋白结构的影响，发现经PPC处理过的胶原可游离出大量胶原单丝，而胶原分子之间的吡啶交联不被破坏。结合上述实验结果，对8种PPC结构域与胶原蛋白单体结构的分子动力学过程进行了模拟，提出了PPC结构域吸附、膨胀胶原蛋白的可能的作用方式，为阐明PPC结构域的功能和作用的分子机制奠定了研究基础。在此基础上，我们又利用酶解效率较高，酶学性质独特的带PPC结构域蛋白酶酶解胶原等低值蛋白资源，获取了一系列具有较高抗氧化活性的功能肽。并利用PPC结构域的胶原吸附和膨胀功能开展了创口辅料改性的研究，为PPC结构域的应用进行了初步探索。