ROCK1介导慢性肾脏病引起的蛋白质能量消耗发病机制的研究

In chronic kidney disease, there is about 30% -50% of patients associated with protein-energy wasting (PEW) which increases morbidity and mortality. The clinical sign of PEW is skeletal muscle atrophy and the mechanisms leading to PEW remains unclear. ROCK1 (RhoA associated kinase 1) is a kinase that expresses abundantly in skeletal muscle, but its role in regulating muscle metabolism is unknown. Our preliminary studies suggested that ROCK1 is a key molecule linked to Akt signaling and mitochondrial dysfunction. Thus, in this proposal, we hypnotize that CKD activates ROCK1 leading to both Akt suppression and mitochondria fission, ultimately resulting in muscle atrophy. Using adenovirus-Cre transfection techniques, gene knockout technology, FRET and other analysis, we plan to validate that CKD activated ROCK1 leads to increased PTEN activity sustainably suppressing p-Akt; meantime ROCK1 activates Drp1 causing mitochondrial fission, ROS release and AMPK activation. We propose a new pathway that regulates muscle protein and energy metabolism in CKD. Since this pathway can be manipulated pharmacologically. The results of our study might be used to define cell biologic responses that are interrupted by CKD. The results also might yield the initial steps towards designing new therapies for this dreaded complication of CKD.

慢性肾脏病（CKD）患者中约30%-50%患者合并蛋白质能量消耗（PEW)， PEW临床体征为肌肉萎缩，其发病机制目前尚不明确。ROCK1是一种磷酸激酶，在骨骼肌肉中表达丰富，但其对肌肉的影响并不清楚。我们的前期研究表明ROCK1的激活是导致CKD肌肉萎缩的重要机制。本课题拟通过特异性操纵ROCK1的活性，从体外到体内验证全新的CKD蛋白质代谢障碍发病机制。采用腺病毒-Cre转染技术、基因敲除技术、FRET等方法，分析ROCK1对肌细胞蛋白质代谢及线粒体的影响，进而提出CKD时激活ROCK1导致PTEN活性升高，持续抑制p-Akt；同时ROCK1通过激活Drp1引起线粒体ROS释放和AMPK激活；这两种机制共同抑制肌肉蛋白质合成并增加蛋白质分解，最终导致肌肉萎缩这一新的机制。本研究有望提出并验证CKD肌肉萎缩发病新机制，并给未来防治CKD肌肉萎缩提供新思路。

慢性肾脏病的发病率逐年升高，许多患者发现时已经处于疾病的晚期，肌肉萎缩作为晚期CKD患者较重的并发症，其发病机制目前尚不明确。ROCK1 是一种磷酸激酶，体内外实验证实，ROCK1参与CKD的肌肉萎缩，且同时伴有线粒体裂变异常。通过特异性操纵 ROCK1 的活性，从体外到体内验证全新的CKD蛋白质代谢障碍发病机制。采用腺病毒-Cre 转染技术、基因敲除技术 等方法，分析 ROCK1 对肌细胞蛋白质代谢及线粒体能量呼吸的影响，进而提出 CKD 时激活 ROCK1 导致 PTEN 活性升高，持续抑制 p-Akt;同时ROCK1 通过激活 Drp1 引起线粒体 ROS 释放和 AMPK 激活;这两种机制共 同抑制肌肉蛋白质合成并增加蛋白质分解，最终导致肌肉萎缩这一新的机制。体外培养成肌细胞，利用Seahorse技术，定量分析，ROCK1过表达，可引起C2C12成肌细胞OCR和ECAR增加，同时可增加C2C12成肌细胞的基础呼吸、细胞最大呼吸，同时影响ATP产生的电子呼吸链的部分过程，导致ATP的产生不足。实验进一步发现，ROCK1过表达导致C2C12成肌细胞线粒体裂变增加：通过线粒体形态特异性染色试剂MitoTracker® 红色荧光探针对C2C12成肌细胞进行染色，结果显示ROCK1过表达后可使C2C12成肌细胞线粒体裂变增加，体积变小，线粒体大小频数分布图左移。为进一步探究ROCK1的抑制剂-法舒地尔，是否可以阻断ROCK1激活所导致的一系列不良过程，实验进一步检测法舒地尔干预的ROCK1激活的C2C12成肌细胞的细胞呼吸以及线粒体形态的改变。实验结果表明：法舒地尔在一定程度上降低ROCK1过表达造成的C2C12成肌细胞呼吸过程中的OCR和EACR的增加;同时，法舒地尔能够减弱ROCK1过表达导致的基础呼吸、最大呼吸的增加，差异具有统计学意义。同时，研究还证实，法舒地尔对线粒体动力相关蛋白活性和肌肉萎缩相关蛋白表达起到一定的作用，法舒地尔能够降低ROCK1过表达引起的促进线粒体裂变的线粒体动力蛋白Drp1活性(p-Drp1/Drp1比例)的增加，以及ROCK1过表达引起的肌肉萎缩相关蛋白MuRF1和 Atrogin-1表达的增加。因此，法舒地尔可在一定程度上抑制ROCK1过表达后对线粒体动力相关蛋白以及肌肉萎缩相关蛋白的表达，且可以改善细胞的呼吸过程。