利用全局转录因子FNR的定向进化提高蓝藻乙醇耐受能力的机制研究

The proposed project focuses on using cell global transcriptional mechanisms Engineering (gTME) to study the mechanism of cyanobacterial ethanol tolerance for its improvement. For the implementation, error-prone PCR and DNA Shuffling will be combined for a directed molecular evolution of the cyanobacterial global transcription factor, FNR (fumarate and nitrate reduction protein). The research objectives include: building the FNR mutant library; constructing ethanol producing cyanobacterial strains; creating FNR-regulated cyanobacterial mutant library; using high-throughput screening tools to obtain cyanobacterial mutants with enhanced ethanol yield and ethanol tolerance. Then we plan to characterize these mutants to identify its altered FNR sequence, to predict and analyze the protein structure for better understanding of the relationship between FNR and ethanol tolerance. Our ultimate goal is to unveil the regulation of FNR on cyanobacterial response to ethanol stress, and to clarify mechanism of cyanobacterial metabolic reprogramming for increased ethanol production. The success of this research may not only improve our scientific understanding on the cyanobacterial ethanol yield and tolerance, but also de-bottleneck commercialization problems in current algal-to-biofuels technology. The research outcomes will promote integration of biology and engineering for a rapid development of bioethanol industry in sustainable alternative energy production.

本项目采用细胞全局转录机制工程((Global transcription machinery engineering，gTME))的方法提高蓝藻乙醇耐受能力的机制研究。主要通过易错PCR与DNA Shuffling相结合对蓝藻全局转录因子FNR 定向进化，构建FNR的突变文库；转化产乙醇基因工程蓝藻，构建FNR调控的蓝藻突变体文库，采用高通量筛选方法获得乙醇耐受性增强和产量提高的突变株。然后通过表征这些突变株的特性，鉴定其FNR突变后的序列，预测蛋白结构，研究FNR与乙醇耐受机制之间的关系，解决FNR通过何种机制调控蓝藻乙醇的产量和耐受性这一科学问题，阐明蓝藻乙醇耐受机理，提高乙醇产量。本项目的开展既能提高蓝藻乙醇产量和耐受能力，阐明乙醇耐受机制，亦能解决蓝藻生物乙醇规模化生产的瓶颈问题，推动第三代生物乙醇产业的发展，为藻类绿色燃料的可持续发展提供藻种原料和技术储备。

本项目以蓝藻和大肠杆菌为研究对象，采用细胞全局转录机制工程((Global transcription machinery engineering，gTME))的方法，重点开展蓝藻和大肠杆菌乙醇耐受能力的机理研究，以揭示其乙醇耐受性的机制。主要研究内容包括蓝藻FNR因子调控乙醇耐受能力机制研究, 大肠杆菌CRP因子调控乙醇耐受能力机制研究和大肠杆菌IHF因子调控乙醇耐受能力机制研究。重要结果：成功构建FNR调控的蓝藻突变体文库：经过多轮筛选获得三株乙醇耐受力强的突变体H1，H2，H3，在5%乙醇胁迫时，H2表现出较高的乙醇耐受性。这三株突变体的FNR序列突变包含了启动子部分和基因部分的突变，耐受乙醇的机制可能首先改变转录因子蛋白质的结构，然后影响到该蛋白转录因子所调控基因的转录水平的高低。成功构建CRP调控的大肠杆菌突变体文库，获得五株长势良好的突变体E1-E5。在高低拷贝载体条件下E3突变株耐受乙醇的能力均最强。高耐受乙醇突变体CRP序列的鉴定表明其中12次发生在第1-134位氨基酸残基即cAMP结合结构域中，2次发生在第135-139位氨基酸残基即中间铰链区结构域中，1次发生在第140-203位氨基酸残基即DNA结合结构域中。大部分的突变发生改变了CRP与cAMP结合形成cAMP-CRP复合物的过程，进而影响到其与RNA聚合酶的结合过程，最终达到改变基因转录水平的目的。成功构建IHF调控的大肠杆菌突变体文库，获得三株突变体M1-M3。突变体的生长虽优于对照组的生长，但是差异不显著。这可能是因为ihf基因的调控基因数量少造成的。课题研究全局转录因子与乙醇耐受机制之间的关系，全局转录因子通过何种机制调控蓝藻乙醇的产量和耐受性这一科学问题，阐明蓝藻乙醇耐受机理，提高乙醇产量，可解决蓝藻生物乙醇规模化生产的瓶颈问题，推动第三代生物乙醇产业的发展，为藻类绿色燃料的可持续发展提供藻种原料和技术储备。