AatA蛋白定向进化提高巴氏醋酸杆菌醋酸耐受能力的机制研究

Acetobacter pasteurianus is a common strain for vinegar fermentation, which is highly inhibited by high concentration of acetic acid. The transporter protein AatA is widespread in acetic acid bacteria. Responsible for identify and transport acetic acid to outside, and enhance the acetic acid tolerance in Acetobacter. But the mechanism of AatA to identify and transport acetic acid is still uncertain. This research will use directed evolution to improve AatA, which will enhance the acetic acid tolerance in A. pasteurianus and clarify the mechanism of acetic acid transport by AatA. The main research of this project contains using error-prone PCR and site-saturation mutagenesis to direct evolution the acetic acid transporter AatA. After the screen work, we will get some strains which have high tolerance to acetic acid and produce more acetic acid. Through analysis the relationship between amino acid mutation and acetic acid tolerance, we can clarify the mechanism about AatA transport acetic acid. In this research we will get some engineering strains with high tolerance to acetic acid and produce more acetic acid. Clarify the mechanism of AatA how to affect acetic acid transport. Furthermore, this research will provide technical reserves for raising other subsequent acetic acid bacteria tolerance to acetic acid.

巴氏醋酸杆菌是常用的醋酸发酵菌种，其发酵过程极易受到产物醋酸的抑制。转运蛋白AatA普遍存在于醋酸杆菌中，负责识别醋酸并将醋酸转运到细胞外，可提高醋酸杆菌的醋酸耐受能力。但是该蛋白识别醋酸和转运醋酸的机制一直不明朗。本研究拟对AatA进行定向进化改造，以提高巴氏醋酸杆菌的耐醋酸能力，进而阐明AatA转运醋酸的机制。主要研究内容：（1）采用易错PCR和点饱和突变技术对AatA进行多轮次定向进化；（2）高通量筛选获得醋酸耐受能力和产量都提高的菌株；（3）探究AatA的氨基酸突变和空间结构变化与醋酸产量提高、耐受性改变之间的内在联系，阐明AatA影响醋酸转运的机制。通过本研究既可以获得醋酸耐受能力和产量都提高的突变株，亦可以阐明AatA影响醋酸转运的机制，为后续提高其他醋酸杆菌的醋酸耐受能力提供技术储备。

巴氏醋酸杆菌是常用的醋酸发酵菌种，其发酵过程极易受到产物醋酸的抑制。转运蛋白AatA普遍存在于醋酸杆菌中，负责识别醋酸并将醋酸转运到细胞外，可提高醋酸杆菌的醋酸耐受能力。但是该蛋白识别醋酸和转运醋酸的机制一直不明朗。本研究以AatA蛋白为研究目标，通过对其进行定向进化改造，筛选到五株产酸能力和耐受醋酸能力都提高的突变体。其中pBBA7638在96h的产酸量达到57.1g/L，是野生型的1.8倍，在不含乙醇的YPG培养基中用70g/L的醋酸处理24h，pBBA7638的菌浓度为8760CFU/ml，大约是野生型的1000倍，突变体的耐受醋酸能力明显提高。在以大肠杆菌为宿主的研究中，发现AatA蛋白能够提高菌体对甲酸、乙酸和丙酸等小分子有机酸的耐受性，表明AatA蛋白参与甲酸、乙酸和丙酸的转运。通过对突变体进行序列分析发现，突变位点大多数位于ATP结合结构域，大部分的突变位点改变了ATP的结合效率和水解速率，提高了AatA蛋白转运乙酸的效率。为了更好的解释该蛋白的作用机理，我们在大肠杆菌中成功表达、纯化，获得了浓度为7.4mg/ml的AatA蛋白，为后续的晶体研究奠定了基础；为了更好的提高醋酸产量，进行了固定化分批发酵研究，共发酵10批次，平均醋酸产量达到46.37g/L，大大提高了突变株的醋酸产量和产率。本研究获得了高产醋酸和高耐受醋酸的突变体，提高了醋酸产量和产率，阐释了AatA蛋白转运乙酸机理，为后续提高其他醋酸杆菌的醋酸耐受能力提供了参考。