全局转录因子σ定向进化提高肺炎克雷伯氏菌发酵木糖生产2,3-丁二醇能力的研究及其调控机理

2, 3-butanediol is a kind of high value-added chemicals and liquid fuel. With good properties in pentose fermentation, K. pneumoniae has a great potential for xylose biotransformation. However, its industrial application is considerably hindered by shortcomings such as poor lactose tolerance. This project intends to improve K. pneumoniae strains with high xylose tolerance and high yield of 2, 3-butanediol phenotype, illustrate the molecular mechanism of phenotype mutation through the transcriptome analysis. The conduction of this subject will improve the fermentation production efficiency of 2, 3 - butanediol by K. pneumoniae and resolve the problem of xylose utilization, which has important economic, social and environmental benefits. This subject will also extend application of directed evolution in the field of biotechnology, make the transformation technology of microbial industrial strains changing from random mutations by using classic physics or chemistry method into directed evolution of specific promoter and cell metabolism network control. The new method used in this project can efficiently improve the xylose tolerance and 2,3-butanediol production performance.

2,3-丁二醇是一种高附加值的平台化合物和液体燃料。肺炎克雷伯氏菌（K. pneumoniae）五碳糖利用性能优良，在木糖生物转化方面极具开发潜力，但其木糖耐受力较低、对2,3-丁二醇转化效率不高，阻碍了其工业化应用。本项目拟通过细胞全局转录因子定向进化的方法获得稳定的高木糖耐受和高产2,3-丁二醇的菌株表型，为K. pneumoniae菌种的改良和构建工作奠定基础。同时通过转录组学分析，阐明突变株耐性提高和高产2,3-丁二醇的分子机制。本课题的开展将提高肺炎克雷伯氏菌木糖发酵生产2,3-丁二醇效率，解决木糖利用难题，具有重要的经济、社会和环境效益。同时也将扩展了定向进化技术在生物技术领域的应用, 使工业微生物菌种改造从经典的物理或化学随机突变向对特定启动子的定向进化和细胞整体代谢网络的操纵转变, 快速高效地提高菌种的耐受性和生产性能。

2,3-丁二醇是一种高附加值的平台化合物和液体燃料。肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella. pneumoniae）五碳糖利用性能优良，在木糖生物转化方面极具开发潜力，但其木糖耐受力较低、对2,3-丁二醇转化效率不高，阻碍了其工业化应用。本研究首先通过易错PCR的方法对全局转录调控因子 sigma 的编码基因 rpoD 定向进化，筛选获得了突变株 KPC；通过适应性进化筛选获得了突变株KP2。在高木糖浓度下利用菌株KP2和KPC发酵，与KPG对比发现， KP2和KPG两株菌在120 g/L木糖初始浓度培养基中，木糖消耗量分别提高了 117 %和 168 %，2,3-丁二醇产量相对原始菌株分别提高了 132.4 %和 115.8 %。对 KPG、 KP2 和 KPC 菌株进行 RNA-seq测序和转录组 de novo 分析，获得三菌株高木糖浓度培养 48 h 时转录本信息，共计 Unigene4539 个，总长 5693375 nt。 以KPG 为对照，分别比较 KP2 和 KPC 菌株基因表达情况， KP2 和 KPC 菌株差异表达基因总数分别为 505 和 674 个。差异表达基因 Pathway 分析表明， KP2 和 KPC 菌株相对出发菌株 KPG，转录水平的变化主要表现在信号转导、跨膜运输、碳水化合物代谢、能量代谢和其它物质代谢，如：核苷酸代谢和氨基酸代谢等方面。 进一步对差异基因进行RT-PCR验证和基因的功能验证，结果表明，RT-PCR的表达量与RNA-seq的上下调的趋势一致；通过过表达上调基因中与跨膜转运相关的基因、参与戊糖磷酸途径的关键基因、糖酵解途的关键基因以及信号转导和电子传递相关的基因，在高木糖浓度条件下与亲本菌株相比耗糖能力和2,3-丁二醇的生产能力都有不同程度上提高，敲除下调基因中与2,3-丁二醇的生产竞争碳源和NADH的副产物途径，2,3-丁二醇的得率也有一定的提高。最后在1L生物反应器中利用响应面法优化了KP2的发酵条件，使2，3-丁二醇的产量提高了32.7%。本研究获得了高木糖耐性的肺炎克雷伯氏菌株，并利用转录组学技术结合功能基因验证探究了突变株耐性提高和高产2,3-丁二醇的分子机制。同时也扩展了定向进化技术在生物技术领域的应用。