CTGF基因低甲基化在糖尿病肾病发病中的作用及机制研究

糖尿病肾病（DN）已成为终末期肾病主要病因之一，结缔组织生长因子（CTGF）作为一种促纤维化因子参与了DN肾脏肥大、肾小球硬化及肾间质纤维化过程，在DN发病中起重要作用。基于前期研究显示CTGF基因启动子区存在典型CpG 岛，CTGF在肾小球系膜细胞及DN患者存在甲基化水平差异等证据，本项目我们提出CTGF基因低甲基化可能参与DN发病的假说，拟通过研究：1)2型DN患者CTGF启动子CpG位点甲基化状态，明确CTGF基因低甲基化对其表达的影响；2)系膜细胞及db/db糖尿病小鼠CTGF甲基化与甲基化CpG结合蛋白、DNA甲基转移酶的相互作用，明确CTGF基因低甲基化的调控机制；3)进一步用叶酸、5-杂氮胞苷干预db/db小鼠模型，分析相应的CTGF 甲基化及CTGF、TGF-β1、FN、ColI表达变化，从而初步阐明CTGF基因低甲基化在DN 发病中的作用及机制，为DN发病提供新的思路。

糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）严重微血管并发症之一，也是DM患者致死和致残的主要原因。越来越多的证据表明DNA甲基化参与了糖尿病及其并发症的发生和发展。结缔组织生长因子（CTGF）是DN发病机制中的重要细胞因子，其水平与DN的发生和预后密切相关。研究已证实CTGF为甲基化敏感基因，CTGF的异常甲基化可能参与了卵巢及肝脏肿瘤的发生。.为明确2型糖尿病患者CTGF基因的甲基化水平及其与CTGF表达的关系，我们应用高效液相色谱(HPLC)法检测了患者基因组DNA甲基化水平，采用甲基化特异性PCR(MSPCR)以及测序法检测了CTGF基因启动子甲基化状态。结果显示DN组患者的基因组DNA甲基化水平与DM组及对照组无差异，但CTGF启动子的甲基化程度明显低于其他两组。Pearson 相关分析显示DM患者的血清CTGF蛋白水平与eGFR、启动子甲基化水平呈负相关，与年龄、FBS、PBS、BUN、Cr和UACR呈正相关。多元逐步回归分析显示UACR、甲基化水平和eGFR是影响CTGF表达的重要因素。因此，CTGF基因启动子的低甲基化可能参与了DN的发生发展。.我们前期研究已证实高糖能诱导人肾小球系膜细胞（HMCs）CTGF基因启动子去甲基化，增加CTGF表达，提示DNA甲基化参与了系膜细胞CTGF基因的表达调控。在此基础上，我们进一步研究了高糖对DNA甲基转移酶（Dnmts）的影响。结果显示虽然高糖不能改变HMCs的Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b蛋白水平，但免疫荧光显示高糖能诱导Dnmt3a发生核移位（出核），Western blot检测也证实胞核内Dnmt3a表达减少而胞浆中Dnmt3a表达增加。CHIP-PCR结果显示在高糖处理HMCs后，Dnmt3a对CTGF启动子调节区域（-97到+151）的结合力减少，从而导致甲基化修饰减弱，CTGF的转录水平增加，其机制可能与高糖改变Dnmt3a的磷酸化水平有关。.我们的研究结果提示高糖可能是通过改变Dnmt3a的磷酸化水平，调控Dnmt3a核移位，导致CTGF基因启动子的甲基化修饰减弱，从而促进了CTGF的表达及DN的发生发展。这一结果丰富了DN的病理生理机制，也为临床治疗提供了一个潜在的干预靶点。