油菜波里马细胞质雄性不育恢复基因的克隆和功能研究

The utilization of heterosis is an effective way to increase crop yield, pol CMS plays an important role in the producing of rapeseed hybrids in China, however the molecular mechanism underlying this kind of cytoplasmic-nuclear interaction remains unclear. In order to clone the restorer gene of pol CMS, the near-isogenic lines (NILs) were developed through repeated backcrossing between polima CMS line and restorer line. Map-based cloning strategy will be used to isolate the fertility restorer gene, the candidate genes will be validated in complementation test. Then, the functional characterization of the Rfp gene will be done, such as gene expression pattern analysis, modification of transcripts of pol CMS-associated orf224/atp6 mtDNA region. Through this project, the Rfp gene with independent intellectual property rights will be cloned and the insights into the mechanism for restoring fertility in rapeseed of pol CMS system will be discovered, which is helpful to develop new restorer lines and hybrid breeding.

利用杂种优势是增加作物产量最重要的方式之一，波里马细胞质雄性不育系(pol CMS)在油菜杂种优势利用中具有举足轻重的作用，但是相关的育性恢复机制还不明晰。为了克隆pol CMS恢复基因Rfp，本实验室前期通过多代回交构建了近等基因系，完成了恢复基因的精细定位，并通过候选基因预测了Rfp的候选基因。此基础上，本项目将利用转基因超表达和RNAi技术验证恢复基因和不育基因，进而利用Real-Time PCR技术、mRNA原位杂交技术、启动子-GUS报告基因系统和亚细胞定位解析恢复基因的时空表达特征，分析近等基因系间差异表达的基因，以及不育基因与恢复基因间的互作方式来剖析恢复基因功能。本项目将克隆到具有自主知识产权的波里马恢复基因，有利于系统的解析pol CMS育性恢复的分子机制，并将推动波里马系统在油菜生产中发挥更大作用。

波里马细胞质雄性不育（pol CMS）是甘蓝型油菜杂种优势利用的主要途径之一，同时也是研究核质互作的良好载体。本课题通过图位克隆的方法克隆了波里马细胞质雄性不育的育性恢复基因Rfp，并利用细胞学和分子生物学方法对其进行了相关研究，阐述了Pol CMS的败育机理及Rfp基因在甘蓝型油菜中的恢复功能。主要研究结果如下：.1.比较测序结果表明Rfp与rfp 启动子区和3，UTR区分别个有一个SNP，而在CDS上存在45个SNP,导致30个氨基酸发生变化，其中12个氨基酸的极性发生变化。亚细胞定位的结果显示Rfp和rfp均定位于线粒体。.2.半薄切片结果表明不育单株花药在发育至第5期已经不能形成四个正常的角隅，向后发育也不能形成药室或者形成1-2个异常的药室，而形成的药室中小孢子的发育异常，最终不能形成产生花粉或者产生干瘪的花粉。透射电镜结果表明不育单株在花药发育的第3期线粒体开始出现异常和崩解，可能引发孢原细胞的PCD。.3. RT-PCR和qPCR分析，结果表明Rfp在根、茎、叶、花和幼蕾各个组织中广泛表达，幼蕾中表达量最高，GUS分析结果与之类似，说明恢复基因可能主要在花药发育早期起重要功能。.4. 以orf224作为探针进行Northern blot的检测,，发现在与不育系相比遗传转化复育系和恢复系中orf224-atp6转录本发生明显减少，而保持系中基本检测不到信号。这表明Rfp可能通过转录后调控的方式参与orf224转录本的加工从而恢复表型。.5.对Rfp进行预测发现它具有15个PPR结构域，可能与RNA识别相关，但它本身不具有RNA剪切或者其他加工的结构域，据此推测可能还存在其他未知蛋白参与该过程。通过酵母双杂，在甘蓝型油菜花蕾cDNA文库中共筛选到了4个可能与Rfp互作的基因，通过BiFC的检测证实这些互作在甘蓝型油菜的线粒体中真实存在。. 这些结果对于研究甘蓝型油菜pol CMS的育性恢复机理的阐释非常重要，对于研究核质互做的研究提供理论依据，为杂种优势的利用提供技术指导。